search

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Ngày đăng: 17/11/2023
Trả lời: 0
Lượt xem: 7

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Show

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

More Related Content

What's hot

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

What's hot(20)

Similar to Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Similar to Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu(20)

Recently uploaded

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì
Vi sinh vật phân giải cellulose tiếng anh là gì

Recently uploaded(20)

Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu

  • 1. KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ CELLULOSE TRONG MỤN DỪA VÀ VỎ TIÊU NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG SVTH: NGÔ HOÀNG HUY MSSV: 0851110095 Tp. Hồ Chí Minh, năm 2012
  • 2. nghiệp Trang i MỤC LỤC 1. Đặt vấn đề.................................................................................................1 2. Tình hình nghiên cứu................................................................................2 2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới......................................................2 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................4 3. Mục đích nghiên cứu ................................................................................5 4. Nhiệm vụ nghiên cứu................................................................................5 5. Phương pháp nghiên cứu...........................................................................5 6. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài.......................................................................5 7. Kết quả đạt được.......................................................................................6 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................7 1.1. Hiện trạng của vỏ tiêu và mụn dừa............................................................7 1.1.1. Vỏ tiêu ...............................................................................................7 1.1.2. Mụn dừa.............................................................................................8 1.2. Thành phần và tính chất hóa học của mụn dừa........................................13 1.2.1. Lignin ..............................................................................................14 1.2.2. Hemicellulose ..................................................................................16 1.2.3. Tannin..............................................................................................18 1.2.4. Cellululose .......................................................................................19 1.2.4.1 .Giới thiệu ...........................................................................................19
  • 3. nghiệp Trang ii 1.2.4.2. Enzyme phân giải cellulose (enzyme cellulase) ...................................22 1.2.4.3. Nguồn gốc enzyme cellulase ...............................................................26 1.2.4.4. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ............................................................................................................34 1.2.4.5. Ứng dụng của enzyme cellulase...........................................................36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................40 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...........................................................40 2.1.1. Thời gian..........................................................................................40 2.1.2. Địa điểm ..........................................................................................40 2.2. Vật liệu...................................................................................................40 2.2.1. Nguồn mẫu.......................................................................................40 2.2.2. Hóa chất...........................................................................................40 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị...........................................................................41 2.2.3.1. Dụng cụ...............................................................................................41 2.2.3.2. Thiết bị................................................................................................42 2.2.4. Thiết kế thí nghiệm ..........................................................................42 2.2.4.1. Mục tiêu ..............................................................................................42 2.2.4.2. Thiết kế thí nghiệm..............................................................................43 2.2.5. Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm ........................................47 2.3. Tiến hành thí nghiệm..............................................................................49 2.3.1. Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu...............................................................................................49
  • 4. nghiệp Trang iii 2.3.1.1. Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt............................................49 2.3.1.2. Thí nghiệm: Sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch...........................................................................................51 2.3.1.3. Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC ......................................................................................52 2.3.2. Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập .........................................................................................................53 2.3.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC.........................................................................................................53 2.3.2.2. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc ................................................................................................54 2.3.3. Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc tế bào, bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase .................................................56 2.3.3.1. Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc,bào tử vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase.......................................................................................................56 2.3.3.2. Thí nghiệm: Khảo sát một số phản ứng sinh hóa các chủng phân lập có hoạt tính cellulase.......................................................................................................58 2.3.4. Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có enzyme cellulase có tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa ............................................................58 2.3.4.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase và FPase ............................................................................................................58 a. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở các pH khác nhau.........................59 b. Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau bằng phương pháp đục lổ thạch.........................................60
  • 5. nghiệp Trang iv c. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH ........................................................................................................61 d. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở các pH ........................................................................................................64 e. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng vi khuẩn ........................................................................................................67 2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập.....................................................................................68 a. Thí nghiệm: Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập... ........................................................................................................68 b. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút ..........................................................69 c. Thí nghiệm: Xác định hoạt tính enzyme FPase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút ................................................................70 2.3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng sinh enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút .............................................................................71 a. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở pH7..............................................71 b. Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme tannase trên đĩa thạch chứa tannic acid ở điều kiện pH7 và lắc 150 vòng/phút..........................................72 c. Thí nghiệm: Xác định hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút ................................................................74 Bảng 2.8: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme tannase ..............................................................................75
  • 6. nghiệp Trang v d. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng chịu tannic acid của các chủng phân lập ở các nồng độ khác nhau 1 %, 3 %, 5 %...................................................75 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................78 3.1. Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu .........................................................................................................78 3.1.1. Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt ........................................78 3.1.2. Sàng lọc mẫu tăng sinh quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch .........................................................................................................78 3.1.3. Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC................................................................................80 3.2. Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập... .........................................................................................................83 3.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC..................................................................................................83 3.2.2. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc..........................................................................................85 3.3. Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn (hoặc xạ khuẩn) phân lập có hoạt tính cellulase..................................87 3.3.1. Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase .............................................................................87 3.3.2. Thí nghiệm: Khảo sát một số phản ứng sinh hóa các chủng phân lập có hoạt tính cellulase............................................................................................92 3.4. Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có enzyme cellulase có tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa .......................................................................95
  • 7. nghiệp Trang vi 3.4.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase và FPase ................................................................................................95 3.4.1.1. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở các pH khác nhau.............................95 3.4.1.2 Thí nghiệm: Định tính (bán định lượng) hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau trên đĩa thạch chứa CMC............................................96 3.4.1.2. Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH ........103 3.4.1.3. Định lượng hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở các pH.............107 3.4.1.4. Khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng vi khuẩn ..........111 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập ..........................................................113 3.4.2.1. Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập...............................114 3.4.1.2. Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút...........................................................................................114 3.4.1.3. Xác định hoạt tính enzyme FPase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút .....................................................................................................115 3.4.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút ..................................................................................116 3.4.3.1. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở pH7................................................116 3.4.3.2. Định tính hoạt tính enzyme tannase trên đĩa thạch chứa tannic acid ở điều kiện pH7 và lắc 150 vòng/phút..........................................................................116 3.4.3.3. Xác định hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút ..........................................................................................................118
  • 8. nghiệp Trang vii 3.4.3.4. Khảo sát khả năng chịu tannic acid của các chủng phân lập ở các nồng độ khác nhau 1 %, 3 %, 5 %.....................................................................................119 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................123 4.1 Kết luận................................................................................................123 4.2 Kiến nghị..............................................................................................124
  • 9. nghiệp Trang viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Diện tích và sản lượng tiêu của vùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên………7 Bảng 1.2: Diện tích dừa ở tỉnh Bến Tre (ha)……………………………………………9 Bảng 1.3: Diện tích, năng suất và sản lượng dừa cả nước…………………………….10 Bảng 1.4: Sản lượng dừa (đơn vị 1.000 trái) của các nước trên thế giới.......................12 Bảng 1.5: Một số ứng dụng của mụn dừa......................................................................12 Bảng 1.6: Phân loại enzyme phân cắt β-1,4-glucan.......................................................24 Bảng 1.7: Enzyme cellulase nguồn gốc từ vi sinh vật...................................................27 Bảng 1.8: Danh sách một số vi khuẩn (kể cả xạ khuẩn) phân hủy cellulose và đặc điểm của chúng.......................................................................................................................28 Bảng 2.1: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất là CMC....................................................................62 Bảng 2.2: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme CMCase theo pH………………………………......................63 Bảng 2.3: Thành phần môi trường hóa chất của thí nghiệm chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn..............................................................................................................................64
  • 10. nghiệp Trang ix Bảng 2.4: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất giấy lọc....................................................................65 Bảng 2.5: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme FPase ở các pH.............................................................................66 Bảng 2.6: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính CMCase ở hai chế độ không lắc và lắc...................................................70 Bảng 2.7: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính FPase..........................................................................................................71 Bảng 2.8: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme tannase..........................................................................................75 Bảng 3.1: Các chủng thu được từ mẫu mụn dừa ở Cao Lãnh................................................................................................................................81 Bảng 3.2: Các chủng thu được từ mẫu mụn dừa ở Lai Vung......................................82 Bảng 3.3: Các chủng thu được từ mẫu vỏ tiêu ở Bà rịa Vũng Tàu.............................82 Bảng 3.4: Hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC.........83 Bảng 3.5: Quan sát hình thái khuẩn lạc..........................................................................87 Bảng 3.6: Kết quả nhuộm gram và nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn phân lập...91 Bảng 3.7: Tổng kết kết quả phân lập và test sinh hóa các chủng...............................94
  • 11. nghiệp Trang x Bảng 3.8: Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM3 ở pH khác nhau.......................................................................................97 Bảng 3.9: Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM4 ở pH khác nhau.......................................................................................97 Bảng 3.10 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM5 ở pH khác nhau.......................................................................................98 Bảng 3.11 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM8 ở pH khác nhau.......................................................................................99 Bảng 3.12 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM10 ở pH khác nhau....................................................................................100
  • 12. nghiệp Trang xi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Các thành phần cấu tạo lignin thực vật…………………………..............15 Hình 1.2: Cấu trúc lignin…………………………........................................................16 Hình 1.3:Một số đường monomer cấu tạo hemicellulose………………………......17 Hình 1.4: Cấu trúc hemicellulose…………………………...........................................18 Hình 1.5: Cấu trúc tannic acid…………………………...............................................19 Hình 1.6: Cấu trúc của cacboxyl methyl cellulose (CMC) …………………….......21 Hình 1.7: Công thức cấu tạo của cellulose…………………………..........................22 Hình 1.8: Cơ chế cắt cơ chất cellulose của enzyme cellulase………………….......26 Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 1…………………………...........43 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 2…………………………...........44 Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 3…………………………...........45 Hình 2.4: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 4…………………………...........46 Hình 2.5: Các mẫu mụn dừa thu thập…………………………..................................49 Hình 2.6: Sơ đồ tăng sinh vi sinh vật chịu nhiệt…………………………..................50
  • 13. nghiệp Trang xii Hình 2.7: Sơ đồ sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật phân huỷ cellulose ……………………….............…...................................................................................51 Hình 2.8: Sơ đồ phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch chứa …………………………...............................................................................................53 Hình 2.9: Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng…………...........54 Hình 2.10: Sơ đồ tiến hành khảo sát khả năng mọc trên môi trường thạch có chứa giấy lọc…………………………..........................................................................................55 Hình 2.11: Mẫu enzyme ở các pH sau khi lọc…………………………..................59 Hình 2.12: Sơ đồ chuẩn bị môi trường lỏng ở các pH khác nhau…………….......60 Hình 2.13: Sơ đồ định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch………………………….................................61 Hình 2.14: Xác định hoạt tính enzyme CMCase………………………….............64 Hình 2.15: Xác định hoạt tính enzyme FPase…………………………...................67 Hình 2.16: Sơ đồ khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng phân lập..68 Hình 2.17: Chuẩn bị môi trường khảo sát hoạt tính enzyme ở hai chế độ lắc và không lắc………………………….........................................................................................69 Hình 2.18: Sơ đồ định tính khả năng sinh enzyme tannase của các chủng…......73 Hình 2.19: Sơ đồ khảo sát khả năng tăng sinh khối của các chủng phân lập trong tannic acid ở các nồng độ khác nhau………………………….............................................77
  • 14. nghiệp Trang xiii Hình 3.1: Sàng lọc quần thể vi sinh vật tăng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch……………………………………………………………………………........80 Hình 3.2: Khả năng mọc khuẩn lạc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc………………………….........................................................................................86 Hình 3.3 :Hình thành sinh khối trong các mẫu môi trường tăng sinh…….............96 Hình 3.4 : So sánh kích thước vòng halo của các chủng ở bốn pH ……...............102 Hình 3.5 : So sánh kích thước vòng halo của các chủng ở pH7……......................102 Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM3…………………..............................................................................................104 Hình 3.7: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM4…...........................................................................................…………….......104 Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM5……………...........................................................................................……...105 Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM8……………….................................................................................................105 Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của BHM10………………..............................................................................................106 Hình 3.11: So sánh hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở pH7………………...........................................................................................….....106
  • 15. nghiệp Trang xiv Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM3…………….......................................................................................……....108 Hình 3.13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM4………………...............................................................................................108 Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM5…………………...........................................................................................109 Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM8………………...............................................................................................109 Hình 3.16: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM10…………….........................................................................................…....110 Hình 3.17: So sánh hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở pH7…………….........................................................................................…….......110 Hình 3.18: Khả năng thủy phân giấy lọc sau 5 ngày…………………................112 Hình 3.19: Khả năng thủy phân giấy lọc sau 10 ngày…………………..............112 Hình 3.20: So sánh phần trăm giảm giấy lọc của các chủng sau 5và 10 ngày..112 Hình 3.21: Hoạt tính CMCase của các chủng ở hai chế độ lắc và không lắc……......................................................................................................................114 Hình 3.22: Hoạt tính FPase của các chủng ở hai chế độ lắc và không lắc….....115 Hình 3.23: Khảo sát hoạt tính enzyme tannase trên môi trường thạch. …....…118
  • 16. nghiệp Trang xv Hình 3.24: Hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút……………………………………………………………..………..…119 Hình 3.25. Sinh khối sau khi ly tâm………………………………………….….120 Hình 3.26: Sinh khối của các chủng ở nồng độ tannic acid khác nhau ……………………................................................................................................…..121
  • 17. nghiệp Trang 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nông nghiệp là ngành kinh tế quan trọng của Việt Nam. Hiện nay, Việt Nam vẫn là một nước nông nghiệp. Năm 2009, giá trị sản lượng của nông nghiệp đạt 71,473 nghìn tỷ đồng (giá so sánh với năm 1994), tăng 1,32 % so với năm 2008 và chiếm 13,85 % tổng sản phẩm trong nước. Tỷ trọng của nông nghiệp trong nền kinh tế bị sụt giảm trong những năm gần đây, trong khi các lĩnh vực kinh tế khác gia tăng. Đóng góp của nông nghiệp vào tạo việc làm còn lớn hơn cả đóng góp của ngành này vào GDP. Trong năm 2005, có khoảng 60 % lao động làm việc trong lĩnh vực nông, lâm nghiệp, và thuỷ sản. Sản lượng nông nghiệp xuất khẩu chiếm khoảng 30 % trong năm 2005. Việc tự do hóa sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa gạo, đã giúp Việt Nam là nước thứ hai trên thế giới về xuất khẩu gạo và nằm trong những nước xuất khẩu các nông sản quan trọng khác là tiêu, sợi bông, đậu phộng, cao su, đường và trà. Tuy nhiên trong sản xuất nông nghiệp hằng năm có khoảng 232 tỷ chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành ở trên đất liền và 60 tỷ tấn được tạo thành trong các đại dương. Trong số này có đến 30 % là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89 % trong bông là 40 - 50 % trong gỗ. Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Mặt khác đứng trước áp lực rút ngắn thời gian nhưng hiệu quả canh tác trên một diện tích đất nông nghiệp phải không ngừng tăng lên người nông dân đã áp dụng các tập quán canh tác mới như cải thiện giống, bón phân,... Hiện nay có rất nhiều loại phân bón sử dụng trong nông nghiệp như: phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi sinh. Tuy nhiên việc phụ thuộc quá nhiều vào phân hóa học và loại bỏ rơm rạ, phụ phế phẩm vừa
  • 18. nghiệp Trang 2 gây ảnh hưởng đến môi trường sống vừa lãng phí một nguồn nguyên liệu sản xuất phân bón thân thiện với môi trường. Do vậy sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh sẽ thay thế dần việc bón phân hoá học trên đồng ruộng, đất trồng trọt mà vẫn đảm bảo được nâng cao năng suất thu hoạch. Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh về lâu dài sẽ dần dần trả lại độ phì nhiêu cho đất như làm tăng lượng phospho và kali dễ tan trong đất canh tác, cải tạo, giữ độ bền của đất đối với cây trồng nhờ khả năng cung cấp hàng loạt các chuyển hoá chất khác nhau liên tục do nhiều quần thể vi sinh vật khác nhau tạo ra. Việc sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh còn có ý nghĩa rất lớn là tăng cường bảo vệ môi trường sống, giảm tính độc hại do hoá chất trong các loại nông sản thực phẩm do lạm dụng phân bón hóa học. Trên thế giới, có hai phương pháp phổ biến để xử lý nguồn cellulose trong tự nhiên: thứ nhất là xử lý bằng vật lý và hóa học; thứ hai là xử lý các chất thải hữu cơ cellulose bằng công nghệ sinh học đặc biệt là sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ các nguồn vi sinh vật, phương pháp này tỏ ra hiệu quả hơn trong việc sản xuất phân bón, chi phí phù hợp và các điều kiện thực hiện đơn giản hơn rất nhiều so với xử lý bằng hóa học chính vì thế hiện nay có nhiều nghiên cứu tối ưu quy trình này nhằm đưa ra sản xuất rộng rãi. Một trong những yếu tố đó là nguồn giống vi sinh, yếu tố đóng vai trò chủ đạo để nâng cao hiệu quả sản xuất phân bón, rút ngắn thời gian ủ,... Từ các vấn đề đặt ra ở trên tôi đi đến chọn đề tài “Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu”. 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng của vi nhuẩn phân hủy cellulose. Trong số đó có nghiên cứu về triển vọng của vi khuẩn phân hủy cellulose sản xuất etanol nhiên liệu. Sinh khối chứa lignocellulosic là một nguồn tài
  • 19. nghiệp Trang 3 nguyên tái tạo phong phú với tiềm năng lớn cho bioconversion để gia tăng gía trị chế phẩm sinh học. Việc đốt cháy dầu mỏ nhiên liệu hóa thạch đã trở thành một mối quan tâm đối với khí hậu toàn cầu. Đốt nhiên liệu hóa thạch cũng đã tạo ra một mối quan tâm đến nguồn dầu khí không ổn định, cũng như, việc tăng chi phí nhiên liệu. Những mối quan tâm này dẫn đến sự nỗ lực toàn cầu nghiên cứu sử dụng nguồn tài nguyên tái tạo mà vẫn đáp ứng nhu cầu năng lượng ngày càng cao của thế giới. Tại Canada tiêu chuẩn nhiên liệu tái tạo được nâng lên để các nhiên liệu sẽ chứa 5 % ethanol (năm 2010), còn ở Hoa Kỳ Cơ quan Bảo vệ môi trường tăng tiêu chuẩn nhiên liệu tái tạo của họ để sản xuất ethanol 10,21 % hỗn hợp nhiên liệu vào năm 2009, trong khi hiện tại tỷ lệ ethanol trộn trong nhiên liệu ở Brazil là 25 % (quy định tại 2007) [2,501-507]. Sinh khối chứa lignocellulosic là một nhiều tiềm năng tài nguyên để sản xuất nhiên liệu sinh học bởi vì nó phần lớn là dồi dào, rẻ tiền. Phế phẩm nông nghiệp là một nguồn chứa lignocellulosic dồi dào và rẻ tiền. nguồn tài nguyên có thể thu từ: lá, thân của một số cây nông nghiệp như: phế thải ngô, bã mía, vỏ trấu, cây thân gỗ. Ngoài ra, một số cây chuyên dụng để sản xuất năng lượng sinh học như một số loại cỏ như: cỏ Miscanthus, cỏ Bermuda,... Để chuyển đổi nguồn nguyên liệu giàu của lignocellulose tới những đường dễ lên men gồm 3 bước: Giảm kích thước. Phân đoạn. Thủy phân enzyme (Pluz Wyman, 1999; Zhang và. Lynd, 2004 B). Một trong những quan trọng nhất và khó khăn thách thức công nghệ là để khắc phục tính bền của vật liệu tự nhiên chứa lignocelluloses, enzyme có khả năng thủy thủy phân để sản xuất các loại đường lên men ở điều kiện thường (Chang và cộng sự, 1981;.
  • 20. nghiệp Trang 4 Demain et al, 2005;. Fan et al, 1982. Grethlein, 1984; Hsu, năm 1996; Lin và cộng sự, 1981; McMillian, năm 1994; Millett et al, 1976;. Moreira, 2005;.Mosier et al, 2005; ngựa để cởi và cộng sự, 1993;. Weil và cộng sự, 1994. ; Wyman, năm 1999; Wyman và cộng sự, 2005a). Gần đây, các công ty công nghệ sinh học Genencor và Novozymes đã cho ra một quy trình công nghệ làm giảm chi phí sản xuất enzyme cellulase từ đó làm giảm chi phí cho quá trình lên men phế phẩm từ 5,40 USD/gallon ethanol xuống khoảng 20 cent/gallon ethanol (Moreira, 2005). Công nghệ này ngoài giảm chi phí sản xuất cellulase còn nhằm nâng cao hiệu suất lên men và rút ngắn thời gian lên men. 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu. Ở Việt Nam, lượng rác thải ra ngoài môi trường ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm môi trường ở nhiều nơi là rất cao. Việc sử dụng biện pháp vi sinh học trong xử lý rác thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý rác thải, thời gian thường kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường, tốn nhiều diện tích và công sức. Để xử lý rác triệt để hơn, giảm giá thành và thời gian xử lý, ngoài việc tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh, chịu được nhiệt độ cao để bổ sung vào các bể rác là một trong những hướng nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5 - 7 ngày. Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện lên men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải.
  • 21. nghiệp Trang 5 Cũng trong năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh. Nghiên cứu về phân lập và định danh các dòng vi khuẩn trong dạ cỏ bò của Võ Văn Phước Duệ và Cao Ngọc Diệp năm 2011. Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trên địa bang tỉnh Thừa Thiên Huế của tác giả Phạm Thị Ngọc Lan. Ngoài ra còn có nghiên cứu khác về phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ các nguồn giàu xơ khác như: trong trấu đang hoai mục, vỏ và bã tiêu,... 3. Mục đích nghiên cứu Nhằm tìm và chọn ra được chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose tốt nhất để tổng hợp thành chế phẩm sinh học và sử dụng nó để sản xuất phân compost, ứng dụng để xử lý rác thải môi trường giàu xơ. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ mụn dừa và vỏ tiêu Sàng lọc và tuyển chọn các chủng làm nguồn giống cho quá trình ủ compost từ mụn dừa. 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thực nghiệm. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu tiến hành sử dụng phần mềm Statgraphics plus 3.0. 6. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
  • 22. nghiệp Trang 6 Ý nghĩa khoa học: việc chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose nhằm nâng cao hiệu quả xử lý phụ phế phẩm giàu xơ, cải thiện ô nhiễm môi trường, đồng thời sản phẩm sau quá trình ủ compost sử dụng làm phân bón phân hữu cơ vi sinh cho quá trình bón lót nhằm cải tạo và làm tăng dinh dưỡng trong đất. Ý nghĩa thực tiễn: ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống sản xuất, bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp ngày càng phát triển bển vững. 7. Kết quả đạt được Thu được 5 chủng (4 chủng vi khuẩn và 1 chủng xạ khuẩn) có khả năng phân hủy cellulose và tannic acid, và tuyển chọn các chủng có tiềm năng ủ compost mụn dừa. Gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan đề tài nghiên cứu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương 3: Kết quả và thảo luận. Chương 4: Kết luận và kiến nghị.
  • 23. nghiệp Trang 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hiện trạng của vỏ tiêu và mụn dừa 1.1.1. Vỏ tiêu Trong những năm gần đây, Việt Nam luôn nằm trong các nhóm nước dẫn đầu về xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới, theo báo cáo mới công bố của Hội đồng hạt tiêu quốc tế (IPC) ước tính lượng tiêu xuất khẩu của Việt Nam trong cả năm 2011 đạt 115.000 tấn, và dự báo năm 2012 là 120.000 tấn. Diện tích trồng hồ tiêu trong nước chủ yếu tập trung tại các vùng Tây Nguyên, Đông Nam Bộ (trong đó Đông Nam Bộ và Tây Nguyên chiếm hơn 78 % diện tích trồng hồ tiêu cả nước), đảo Phú Quốc. Bảng 1.1: Diện tích và sản lượng tiêu của vùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên 6 tỉnh trọng điểm Năm 2011 Năm 2012 Diện tích trồng Diện tích thu Năng suất Sản lượng Diện tích trồng Diện tích thu Năng suất Sản lượng Tổng 42.171 37.153 2,46 91.535 44.279 38.102 2,37 90.168 Bình Phước 9.566 9.181 2,85 26.155 10.140 9.015 3,07 27.682 Gia Lai 5.832 4.881 3,22 15.733 5.794 5.234 3,27 17.129 Đồng Nai 7.021 6.273 2,09 13.111 8.125 7.101 1,46 8.304
  • 24. nghiệp Trang 8 Đăk Nông 7.915 6.130 2,15 13.096 8.000 6.022 2,29 13.814 Bà Rịa Vũng Tàu 6.939 6.304 1,86 11.725 7.370 6.364 1,72 10.954 Đăk Lăk 4.898 4.383 2,67 11.715 4.850 4.366 2,81 12.285 (Nguồn: theo thống kê của Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam (VPA)) Sở dĩ hồ tiêu Việt Nam có thể phát triển một cách rực rỡ như vậy là do Việt Nam hội tụ tất cả các điều kiện thuận lợi về tự nhiên, về con người, về ứng dụng khoa học kỹ thuật trong sản xuất và chế biến. Tuy nhiên, song song với những phát triển về sản lượng và chất lượng, người nông dân trồng hồ tiêu đã và đang đối mặt với tình trạng sâu hại, bất lợi về thời tiết và đặc biệt là giá thành phân bón tăng cao. Mặc khác lượng phế phẩm từ hồ tiêu (chủ yếu là vỏ tiêu) với số lượng lớn khoảng 16.666 tấn/năm nếu không có các biện pháp xử lý thì chúng là nguồn gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Việc nghiên cứu phương pháp compost để xử lý phế phẩm này vừa giải quyết được ô nhiễm vừa tạo ra giá trị kinh tế cao. Sỡ dĩ vỏ tiêu được chọn làm nguyên liệu để ủ compost vì trong vỏ tiêu chứa hàm lượng chất dinh dưỡng cao nên người ta có thể sử dụng bã cà phê như một chất bón cây rất hữu hiệu. Trong thành phần của nó chứa nhiều canxi, phốt pho, nitơ cũng như các chất khoáng khác giúp ích cho sự phát triển của cây. Khi đó giá thành của loại phân bón hữu cơ này chỉ bằng khoảng 30 % so với các loại phân khoáng bán trên thị trường. Hơn nữa, sử dụng các loại phân hữu cơ sinh học từ xác, bã thực vật nói chung và vỏ quả cà phê nói riêng bón cho các loại cây trồng sẽ góp phần cân bằng hệ sinh vật trong đất. Từ đó, cải thiện được kết cấu, độ xốp, độ phì nhiêu của đất. 1.1.2. Mụn dừa
  • 25. nghiệp Trang 9 Bến Tre có diện tích và sản lượng dừa lớn nhất Việt Nam, với hơn 52.000 ha dừa (chiếm 51,23 % diện tích cây lâu năm; 24,795 % đất nông nghiệp và chiếm 19,07 % diện tích tự nhiên) chiếm 2/3 diện tích, sản lượng dừa cả nước và đứng hàng đầu về chất lượng, sản lượng thu hoạch hàng năm đạt trên 390 triệu trái, chiếm 36 % sản lượng cả nước là cây có diện tích lớn nhất và ổn định nhất so với các cây khác trên địa bàn tỉnh Bến Tre. Giá trị sản xuất các sản phẩm dừa chiếm hơn 25 % tổng giá trị sản xuất công nghiệp toàn tỉnh; kim ngạch xuất khẩu các sản phẩm từ dừa không ngừng gia tăng, có lúc chiếm tới hơn 40 % tổng kim ngạch xuất khẩu của tỉnh, sản phẩm dừa đã xuất khẩu đến trên 50 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới. Ngành dừa luôn đóng vai trò quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội tỉnh. Trái dừa ngoài đáp ứng cho nhu cầu giải khát ngày càng tăng nhất là ở các thành phố lớn Bến Tre cung cấp khoảng 150 – 200 triệu trái/năm, hiện nay một số ngành nông nghiệp phát triển từ nguồn nguyên liệu dừa cũng tăng theo từng năm cho ra nhiều sản phẩm có giá trị như: cơm dừa nạo sấy, dầu dừa, kẹo dừa, thạch dừa, chỉ xơ dừa, thảm xơ dừa, vỏ dừa cắt lát, mụn dừa, than hoạt tính và khoảng 100 sản phẩm hàng thủ công mỹ nghệ từ cây dừa, trái dừa, gáo dừa, cọng dừa, chà dừa, nhen dừa được xuất khẩu sang nhiều quốc gia trên thế giới. Bảng 1.2: Diện tích dừa ở tỉnh Bến Tre (ha) Đơn vị/năm 2005 2008 2009 2010 2011 Toàn tỉnh Bến Tre 37.595 47.569 49.920 51.560 55.870 Trong đó: Thành phố Bến Tre 1.336 1.492 1.500 1.528 1.869 Châu Thành 4.960 5.297 5.453 5.541 6.352
  • 26. nghiệp Trang 10 Chợ Lách 914 1.154 771 803 1.098 Mỏ Cày Nam 12.908 17.956 12.607 12.869 13.625 Mỏ Cày Bắc 6.955 7.244 8.120 Giồng Trôm 10.071 12.048 12.569 13.007 13.957 Bình Đại 4.452 5.204 5.435 5.840 5.445 Ba Tri 750 1.371 1.370 1.413 1.490 Thạnh Phú 2.204 3.047 3.260 3.315 3.914 (Theo Niên giám thống kê của Cục Thống kê tỉnh Bến Tre, tính đến năm 2011) Bảng 1.3: Diện tích, năng suất và sản lượng dừa cả nước Năm Diên tích (ha) Năng Suất (tr/ha/năm) Sản lượng (trái) 1999 32.364 6.436 208.294.704 2000 37.758 7.016 264.910.120 2001 35.540 6.252 222.196.080 2002 35.262 6.032 212.700.384 2003 35.018 6.784 237.562.112 2004 35.855 7.350 263.754.750 2005 36.827 7.508 276.497.116
  • 27. nghiệp Trang 11 2006 34.104 7.961 271.501.944 2007 34.906 8.520 287.974.500 2008 47.569 7.425 353.199.825 Về tính toán tốc độ phát triển bình quân của diện tích, năng suất và sản lượng dừa như sau: Diện tích: 103.93 % Năng suất: 101.44 % Sản lượng: 105.42 % (Nguồn: Thống kê tỉnh Bến Tre năm 2004 - 2007 và cung cấp của Phòng Tổng Hợp Cục Thống Kê Bến Tre) Cây dừa tiếp tục giữ vị trí quan trọng trong các quốc gia trồng dừa, đặc biệt là khu vực Châu Á - Thái bình dương. Diện tích và sản lượng dừa tiếp tục gia tăng cùng với giá cả hấp dẫn hơn của những sản phẩm như là sữa dừa, cơm dừa nạo sấy... giúp các nước trồng dừa tăng thêm nguồn thu ngoại tệ từ việc xuất khẩu các sản phẩm chế biến từ dừa. Sản lượng dừa thế giới hiện nay đạt 11.439 triệu tấn cơm dừa khô (trong đó các nước thuộc APCC đạt 9.442 triệu tấn, chiếm 82,54 %). Indonesia là nước dẩn đầu về diện tích dừa với 3,98 triệu ha, Philippines xếp thứ hai với 3,26 triệu ha, Ấn Độ xếp thứ ba với 1,92 triệu ha dừa, kế tiếp là Sri Lanka với 394.836 ha. Sản lượng dừa ở các quốc gia quy ra trái giai đoạn 2000 - 2004:
  • 28. nghiệp Trang 12 Bảng 1.4: Sản lượng dừa (đơn vị 1.000 trái) của các nước trên thế giới Quốc gia 2000 2001 2002 2003 2004 Indonesia 15..237.000 15.815.000 15.492.000 16.146.000 16.657.000 Philippines 12.995.000 13.146.000 14.068.000 14.294.000 12.459.000 Sri Lanka 3.096.000 2.769.000 2.393.000 2.562.000 2.591.000 Việt Nam 1.031.960 935.640 789.550 693.500 680.684 Tuy nhiên trong quá trình sản xuất nông nghiệp nói chung và sản phẩm từ dừa nói riêng nhất thiết phải thải một khối lượng lớn các phụ phế thải vào môi trường, trong đó mụn dừa là một trong những phế liệu khó xử lý để tái sử dụng do hàm lượng cellulose, lignin và tannase trong mụn dừa khá cao. Theo ước tính của Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bến Tre, hiện mỗi ngày các cơ sở sản xuất chỉ xơ dừa trong tỉnh thải ra khoảng 1000 tấn mụn dừa. Do không có kho bãi chứa và các cơ sở này chủ yếu sản xuất nhỏ lẻ nên lượng mụn dừa này được thải trực tiếp ra sông gây ô nhiễm nghiêm trọng đến nguồn nước và không khí. Một số hộ dân sử dụng mụn dừa này để phủ gốc và bón lót cho cây nhưng số lượng không đáng kể so với nguồn phế liệu khổng lồ này. Hiện nay có một số ứng dụng mụn dừa vào trong nông như nghiệp như: Bảng 1.5: Một số ứng dụng của mụn dừa Mục đích Ứng dụng 1 Làm đất sạch Mụn dừa qua quá trình xử lý, kết hợp vi sinh thành một loại đất trồng hữu cơ có các đặc tính ưu việt: Tơi xốp, thoáng khí, dễ thấm nước, giữ ẩm cao, không mang mầm bệnh, chứa nhiều vi sinh vật có lợi cho đất. Sau 6
  • 29. nghiệp Trang 13 tháng sử dụng, đất sạch trở nên “mùn hoá” có ích cho cây trồng. 2 Giá thể trồng nấm Mụn dừa còn là nguyên liệu tốt để làm giá thể trồng nấm rơm và nấm bào ngư. Do có độ xốp, khả năng giữ nước, giữ chất dinh dưỡng. 3 Nguyên liệu sản xuất phân hữu cơ sinh học Mụn dừa là nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ vi sinh: Sau khi mụn dừa được sấy khô loại bỏ tạp chất có hại, áp dụng tiếp kỹ thuật vi sinh sẽ cho ra sản phẩm phân hữu cơ vi sinh, giúp cải tạo đất bạc màu một cách hiệu quả. 1.2. Thành phần và tính chất hóa học của mụn dừa Mụn dừa là chất hữu cơ và có thể tái sử dụng. Mụn dừa là chất nền trên mặt đất, do đó có thể ngăn chặn những tác nhân có hại cho đất. Độ pH của mụn dừa khoảng 5.5. Chất lượng mụn dừa không bị ảnh hưởng nếu pH thấp hơn. Tỷ lệ C/N khoảng 80:1. Độ xốp khoảng 10 - 12 %. Chất hữu cơ khoảng 94 - 98 %. Tổng lượng tro khoảng 3 - 6 %. Cellulose khoảng 20 - 30 %. Lignin khoảng 69 - 70 %. Tannin khoảng 8 – 8,5 %.
  • 30. nghiệp Trang 14 Trong thành phần của mụn dừa, tannin chiếm tỷ lệ tương đối lớn so với các loài thực vật khác. 1.2.1. Lignin Là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật đặc biệt là thực vật bậc cao (hạt trần, hạt kín), thường tập trung ở những mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, lignin chiếm tỷ lệ cao ở những mô mạch được chuyển hóa để vận chuyển chất lỏng chúng có chức năng chống thấm nước qua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh. Khác với cellulose và hemicellulose, lignin hình thành từ các dẫn xuất của phenyl, propan, một chất thơm có mạch nhánh. Lignin là một polymer gốc rượu, có cấu trúc 3 chiều rất phức tạp và có nhiệm vụ nâng đỡ tế bào. Sau cellulose, lignin là một polymer phong phú trong tự nhiên được thực vật tổng hợp và chiếm khối lượng rất lớn nguồn chất thơm trên trái đất. Lignin giúp tế bào thực vật cứng hơn và giúp cho thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Lignin được tìm thấy trong vách tế bào ở dạng phức hợp các polysaccharide khác như cellulose và hemicellulose, nó cũng giúp bảo vệ các polysaccharide này khỏi sự phân hủy sinh học. Có thể phân loại lignin theo thành phần chứa nó như lignin gỗ cứng, lignin gỗ mềm và lignin cỏ. Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn. Lignin gỗ mềm (thực vật hạt trần): bao gồm những cấu trúc chủ yếu bắt nguồn từ rượu coniferyl, một ít từ p-coumaryl, không có sinapyl. Lignin gỗ cứng (thực vật hạt kín) chứa số lượng cân bằng coniferyl và sinapyl (46 %) và một lượng nhỏ (8 %) coniferyl p-hydroxylferylpropan (có nguồn gốc từ coumaryl).
  • 31. nghiệp Trang 15 Lignin cỏ là hợp chất của coniferyl, sinapyl và p-hydroxyphenylpropan với coumaric acid (5 - 10 %) chủ yếu là ester với nhóm hydroxyl tận cùng của rượu p- coumaryl. Thành phần của lignin gồm 62 - 65 % cacbon, 5 - 6 % hydro, nhiều nhóm metoxyl (-OCH3) và nhiều nhóm hydroxyl (-OH) tự do. Hình 1.1: Các thành phần cấu tạo lignin thực vật Rượu oxyhydro coniferilic là nhân tố cấu tạo chủ yếu của lignin. Các liên kết phổ biến trong lignin là aryl-aryl, aryl-glycerol, diarylete. Ngoài ra còn các kiểu liên kết phenyl-cumaryl, biphenyl, diarylete. Vì dẫn xuất của các hợp chất thơm có mạch bên nhiều nhóm chức hoạt động, đặc biệt là –OH của nguyên tử cacbon (đối với vòng thơm) nên lignin tham gia vào nhiều loại phản ứng đặc trưng khác hẳn với cellulose và hemicellulose như: phản ứng thế, phản ứng ester hóa, oxy hóa, dimetyl hóa. Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và tan trong acid vô cơ. Dưới tác dụng của kiềm bisulfitnatri và acid sulfuric thì lignin mới bị phân giải một phần và chuyển sang dạng hòa tan.
  • 32. nghiệp Trang 16 Hình 1.2: Cấu trúc lignin 1.2.2. Hemicellulose Khác với cellulose, phân tử hemicellulose nhỏ hơn nhiều thông thường không quá 150 gốc đường, được nối với nhau không chỉ bằng liên kết 1,4 mà còn liên kết 1,3 và 1,6-glucoside tạo ra mạch ngắn và phân nhánh Hemicellulose là một heterpolymer có ở trong vách tế bào thực vật cùng với cellulose. Hemicellulose không tan được trong nước chỉ tan được trong dung dich kiềm. Hemicellulose có cấu trúc vô định hình và ít bền vững. Nó dễ bị phân hủy bởi các enzyme hemicellulase. Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan. Các polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như gỗ, rơm rạ, v.v…
  • 33. nghiệp Trang 17 Trong thiên nhiên loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan. Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ... Xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-xylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên. Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác. Hemicellulose chứa nhiều đơn phân đường khác. Ngoài glucose, các phân tử đường trong hemicellulose có thể là nhóm hexose (mannose, galactose) và nhóm pentose ( xylose, arabinose). Hemicellulose chứa hầu hết các đường D-pentose và một ít các đường dạng L. Hình 1.3:Một số đường monomer cấu tạo hemicellulose
  • 34. nghiệp Trang 18 Hình 1.4: Cấu trúc hemicellulose 1.2.3. Tannin Tannin (tannin thực vật - phân tử sinh học, hoàn toàn khác so với tannin tổng hợp) là chất làm se, đắng. Là nhóm các polyphenol tồn tại phổ biến trong thực vật, có khả năng tạo liên kết bền vững với protein và một số hợp chất cao phân tử thiên nhiên (cellulose, pectin). Tannin có phân tử khối từ 500 - 3000 đvC, có khả năng kết tủa với gelatin (protein loại collagen được chiết xuất từ da, xương động vật, ở nhiệt độ thường có thể rắn) và các protein khác trong môi trường nước. Tannin tan trong nước đặc biệt là nước nóng, cồn hay kiềm loãng, không tan trong dung môi hữu cơ, tạo tủa với protein, gellatin, không bay hơi... Trong trà, tiêu, rượu vang (đặc biệt là rượu vang đỏ), lựu, hồng, dâu, trong các loại rau làm gia vị (đinh hương, ngải quế...), trong các quả non (vì thế quả bơ non
  • 35. nghiệp Trang 19 thường đắng hơn quả bơ chín) đều chứa tannin, đặc biệt trong các thực vật già, thân đã hóa gỗ thì tannin càng nhiều. Trong thực vật có 2 loại tannin sau: Tannin thủy phân được (hydrolysable tannin), tiêu biểu đó là acid gallic HOOCC6H2(OH)3 (IUPAC: acid 3,4,5-trihydroxybeoic). Tannin không thủy phân được (Condzensed Tannin) còn gọi là proanthyocyanidins, tiêu biểu đó là flavones C15H10O2 (IUPAC: 2-phenylchromen-4- one (2-phenyl-1-benzopyran-4-one). Hình 1.5: Cấu trúc tannic acid 1.2.4. Cellululose 1.2.4.1 .Giới thiệu
  • 36. nghiệp Trang 20 Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50 % và trong bông chiếm khoảng 90 %), là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, đó chính là nguồn năng lượng vô tận cho sự phát triển cho sự phát triển xã hội. Theo đó, cellulose được tìm thấy trong hầu hết các loại chất thải hữu cơ và chiếm tỉ lệ cao trong thành phần cấu trúc từ các chất thải của ngành công nghiệp gỗ, nông nghiệp và chất thải gia đình. Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n mức độ polymer hóa của cellulose rất cao tới 10000 - 140000 đơn vị glucose/phân tử. Cellobiose là lặp đi lặp lại đơn vị nhỏ nhất của cellulose và có thể cuối cùng được chuyển đổi thành glucose. Về bản chất hóa học cellulose là một rượu đa chứa có phản ứng với kiềm hay kim loại kiềm tạo cellulose-alcolate. Nguyên tử hydro ở các nhóm OH bậc một và hai trong phân tử cellulose cũng có thể bị thay thế bởi các gốc metyl, etyl,... tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan cao trong nước khác nhau. Cellulose là polymer thẳng của các đơn vị β-D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucoside. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen người ta biết rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi. Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibril có cấu trúc không đồng nhất. Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết bằng kiên kết Van der Waals nên dễ bị tấn công.
  • 37. nghiệp Trang 21 Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài phân tử cellulose kết tinh. Các cây gỗ lâu năm thường chứa hàm lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc thì ngược lại, chứa nhiều cellulose vô định hình. Trong vách tế bào thực vật, cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ với các polysaccharide khác: hemicellulose, pectin và lignin tạo thành liên kết bền vững. Cellulose bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần là oxy-cellulose. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO4). Đặc biệt cellulose hòa tan trong dung dịch cupri hydrate (Cu(NH3)4(OH)2), và hàng loạt các phức chất của đồng, niken, kẽm... Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dạng tự do, hydro của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất este hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng dụng nhiều là CMC (cacboxyl methyl cellulose), trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH. Hình 1.6: Cấu trúc của cacboxyl methyl cellulose (CMC) Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose
  • 38. nghiệp Trang 22 có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn. Hình 1.7: Công thức cấu tạo của cellulose 1.2.4.2. Enzyme phân giải cellulose (enzyme cellulase) Sự phân giải cellulose rất phức tạp, đòi hỏi sự có mặt của nhiều enzyme như endoglucanase, β-glucosidase, cellobiohydrolase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase tham gia thủy phân phân tử cơ chất theo một cơ chế riêng. Tuy nhiên, những enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose.
  • 39. nghiệp Trang 23 Cellulase là enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase) hoạt động phối hợp trong việc thủy phân cellulose thành glucose ở nhiệt độ thường hoặc 40 - 50 o C. Hệ cellulase gồm ba thành phần chính: Enzyme thứ nhất là 1,4 β -D-glucan cellobiohydrolase (tên khoa học khác: cellobiohydrolase, enzyme C1, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase) – EC.3.2.1.4 (CBH) . Enzyme này cắt hai đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Trọng lượng phân tử của enzyme này là từ 53 - 75 kDa. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng. Enzyme thứ hai là 1,4 β-D-glucan- 4 -glucanohydrolase (tên gọi khác: endoglucanse, endo 1,4-β-glucanase, enzyme Cx)- EC 3.2.1.6 (EG) chứa 418 acid amine, có trọng lượng phân tử từ 42 – 49 KDa. Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose trong lichenin và β -D- glucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose. Enzyme thứ ba là β-D-glucoside glucohydrolase (tên khác là cellobiase và β -glucosidase) có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4 – 4,8) EC.3.2.1.21, trọng lượng phân tử khoảng 50 – 98 KDa, pI = 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Chúng tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose, không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Nhiều nghiên cứu cho rằng các enzyme EG có tác dụng phân cắt tốt trên cellulose vô định hình và đặc biệt có tác dụng trên cơ chất celluolose biến tính CMC, HEC. Vì vậy, để xác định hoạt tính enzyme này người ta sử dụng cơ chất là CMC. Còn các enzyme CBH thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít trên cellulose vô định hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính. Cơ chế phối hợp cắt cellulose: Đầu tiên enzyme EG tấn công vào giữa mạch cellulose. Tiếp sau đó enzyme CBH tiếp tục phân cắt để tạo các sản phẩm cuối là
  • 40. nghiệp Trang 24 cellobiose. Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzyme thứ ba là β- glucosidase. Tuy enzyme β-glucosidase không tác dụng trên chuỗi cellulose nhưng vẫn được xếp vào hệ thống enzyme cellulase. Bảng 1.6: Phân loại enzyme phân cắt β-1,4-glucan
  • 41. nghiệp Trang 25 Tên hệ thống Tên thường gọi EC No. Cơ chất Liên kết thủy phân Sản phẩm chính Endo -1,4-D-glucan-4- glucanohydrolase Cellulase, endoglucanase (EG) 3.2.1.4 Cellulose, 1,3-1,4-- glucans 1,4- 1,4--dextrins, 1,3-1,4-- dextrins -1,3-1,4-D-glucan-4- glucanohydrolase Lichenase, -glucanase 3.2.1.73 Lichenin, 1,3-1,4-- glucans Kế 1,4- sau 1,3-- Hỗn hợp 1,3-1,4-- dextrins -1,3-D-glucan-3/4- glucanohydrolase Laminarinase 3.2.1.6 Laminarin, 1,3-1,4-- glucan Kế liên kết 1,4-- hoặc 1,3-- và sau 1,3-- Hỗn hợp 1,3-1,4-- dextrins -1,3-D-glucan-3- glucanohydrolase Laminarinase 3.2.1.39 Laminarin, pachyman (1,3-1,4--glucans) 1,3- 1,3--dextrins (1,3-- dextrins) Exo -1,4-D-glucan- cellobiohydrolase Cellobiohydrolase (CBH) 3.2.1.91 Cellulose, 1,3-1,4-- glucans 1,4- Cellobiose -1,4-D-glucan- glucohydrolase Exoglucanase 3.2.1.74 1,4--glucans 1,4- Glucose -glucosidase Cellobiase 3.2.1.21 -D-glucosides 1,4-, 1,3- và 1,6- Glucose
  • 42. nghiệp Trang 26 Hình 1.8: Cơ chế cắt cơ chất cellulose của enzyme cellulase 1.2.4.3. Nguồn gốc enzyme cellulase Rất nhiều loài nấm và vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose. Gồm những cơ chế yếm khí hay hiếu khí, ưa nhiệt hoặc ưa nhiệt trung bình. Chúng rất đa dạng và phong phú và đa dạng trong tự nhiên nhưng chỉ có một số ít sinh enzyme ngoại bào, có khả năng phân hủy cellulose kết tinh trong ống nghiệm. Cellulose Cellulose phản ứng Cellobiose Glucose Cx C1 β-gluosidase
  • 43. nghiệp Trang 27 Bảng 1.7: Enzyme cellulase nguồn gốc từ vi sinh vật  Vi khuẩn Vi khuẩn sinh ra chủ yếu endoglucanase và β-glucosidase gần như không tạo ra exoglucanase. Vi khuẩn trong dạ cỏ: Ruminococcus albus. Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas persica sp. và Cellulomonas iranensis sp.
  • 44. nghiệp Trang 28 Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium thermocellum, Clostridium cellulovorans, Clostridium celluloliticus. Cellulase từ vi khuẩn trong nhiều trường hợp được nghiên cứu có hoạt tính cao hơn cellulase từ nấm mốc. Tuy nhiên nhìn chung vi khuẩn sản xuất enzyme ngoại bào số lượng thấp hơn nấm mốc. Do đó trong cellualase từ vi khuẩn sản xuất từ công nghiệp cần có phương pháp thu enzyme thích hợp. Vi sinh vật hiếu khí có thể phân hủy vật liệu giàu xơ bao gồm các thành phần khác, trong khi vi sinh vật kị khí chỉ có phân hủy cellulose. Các vi sinh vật kị khí thường được phân lập trong dạ cỏ đại gia súc hay bồn ủ kị khí. Các vi sinh vật phân hủy trong hố ủ compost, bùn họat tính thường là vi sinh vật hiếu khí. Một số chịu nhiệt vì được phân hủy từ suối nước nóng, đa số ưa ấm.  Xạ khuẩn Nhiều loại xạ khuẩn thuộc giống Streptomyces được phát hiệm có khả năng sinh ra cellulase.Streptomyces antibioticus, Streptomyces thermoviolaceus var. Oingenes, Strptomyces cellulolyticus sp. Bảng 1.8: Danh sách một số vi khuẩn (kể cả xạ khuẩn) phân hủy cellulose và đặc điểm của chúng Phân loại Giống Loài Nhiệt độ Nguồn phân lập Tài liệu tham khảo Họ Syntrophom onodaceae Caldocellulos iruptor Saccharolyticus Chịu nhiệt Suối nước nóng Rainey et al. 1994 "Anaerocellu Thermophilum Chịu nhiệt Suối nước nóng Svetlichnyi et
  • 45. nghiệp Trang 29 m" al. 1990 Lachnospira ceae Butyrivibrio Fibrisolvens Ưa ấm Dạ cỏ Berger et al. 1990 Ruminococcu s Flavefaciens Ưa ấm Dạ cỏ Aurilia et al. 2000 Họ Eubacteriac eae Eubacterium Cellulolyticum Ưa ấm Dạ cỏ Anderson & Blair 96 Họ Clostridiace ae Clostridium Acetobutylicum Ưa ấm Đất From sequence Clostridium Cellulovorans Ưa ấm Gỗ lên men Shoseyov et al. 1992, Tamaru et al. 2000 Clostridium Herbivorans Chịu nhiệt Ruột lợn Varel et al. 1995 Clostridium Cellulosi Chịu nhiệt Phân bón Yanling et al. 1991 Clostridium Cellobioparum Ưa ấm Dạ cỏ Lamed et al. 1987
  • 46. nghiệp Trang 30 Clostridium Papyrosolvens Ưa ấm Bột giấy Pohlschröder et al. 94 Clostridium Cellulolyticum Ưa ấm Compost Pagés et al. 1997, Belaich et al. 1997 Clostridium Thermocellum Chịu nhiệt Nước thải + đất Lamed et al. 1991 Clostridium Cellulofermentan s Ưa ấm Phân bón Yanling et al. 1991 Clostridium sp. C7 Ưa ấm Bùn Cavedon et al. 1990 Bacteroides sp. P-1 Ưa ấm Sinh khối thối rữa Ponpium et al. 2000 Bacteroides Cellulosolvens Ưa ấm Nước thải Lamed et al. 1991 Họ Thermoacti nomycetacea e Thermoactino myces sp. YX Chịu nhiệt Hägerdahl et al., 1979 Caldibacillus Cellulovorans Chịu nhiệt Sunna et al.
  • 47. nghiệp Trang 31 2000 Họ Bacillaceae Bacillus Circulans Ưa ấm Kim 1995 Bộ Frankineae, Họ Acidotherm aceae Acidothermus Cellulolyticus Chịu nhiệt Suối nước nóng có tính acid Eppard et al. 1996; Maréchal et al. 2000 Cellulomonas Biazotea Ưa ấm Lednicka et al 2000 Bộ Micromonos porineae, Họ Cellulomona daceae Cellulomonas Cartae Ưa ấm Thayer et al. 1984 Cellulomonas Cellasea Ưa ấm Lednicka et al. 2000 Cellulomonas Cellulans Ưa ấm Đất Lednicka et al. 2000 Cellulomonas Fimi Ưa ấm Đất Lednicka et al. 2000 Cellulomonas Flavigena Ưa ấm Đất Lednicka et al.
  • 48. nghiệp Trang 32 2000 Họ Microbacter iaceae Micromonosp ora Melonosporea Ưa ấm Compost Wilson 1992 Họ Micromonos poraceae Actinoplanes Aurantiaca Ưa ấm Đất Coughlan & Mayer 92 Streptomyces Reticuli Ưa ấm Đất Schrempf & Walter 96 Streptomyces Aureofaciens Ưa ấm Compost El-Din et al. 2000 Streptomyces Flavogriseus Ưa ấm Đất MacKenzie et al. 1984 Streptomyces Rochei Ưa ấm Ruột mối Perito et al. 1994 Streptomyces Viridosporus Coughlan & Mayer 92 Thermobifid a(Thermomo nospora) Fusca Chịu nhiệt Đất Wilson 1992; Kukolya, pers. commun. 2003
  • 49. nghiệp Trang 33 Thermobifid a Cellulolytica Chịu nhiệt Compost Kukolya et al. 2002 Microbispora Bispora Chịu nhiệt Đất Wilson 1992 Họ Streptospor angiaceae Họ Fibrobacteri aceae Fibrobacter Succinogenes Ưa ấm Dạ cỏ Schellhorn & Forsberg 1984 Họ Flexibacteri aceae Sporocytoph aga Myxococcoides Ưa ấm Đất Coughlan & Mayer 92 Cytophaga sp. Ưa ấm Đất Mullings et al. 1984 (Nguồn: http://ijsb.sgmjournals.org/content/54/2/533.full)  Nấm sợi Nấm được nói chung quan trọng hơn vi khuẩn phân hủy cellulose, đặc biệt là các trường hợp nếu cellulose có thêm với lignin (ví dụ, trong gỗ hoặc rơm). Vì cellulose giàu cacbon nhưng không chứa nitơ hoặc các yếu tố thiết yếu khác, các cấu trúc sợi nấm của nấm là một lợi thế cạnh tranh. Một vài loại nấm kể đến là Chaetonium, Fusarium, và Aspergillus.
  • 50. nghiệp Trang 34 Nhiều loại nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Pinicillium, Cladosporum... Trong đó 2 giống Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase. Giống Trichoderma sinh tổng hợp một lượng tương đối lớn endoglucanase và exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít β-glucosidase, trong khi các chủng thuộc giống Aspergillus sinh ra một lượng tương đối lớn endoglucanase và β-glucosidase nhưng chỉ một lượng nhỏ exoglucanase. Ngoài ra, cellulase còn có mặt trong các hạt của thực vật bậc cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu róm và ốc sên. Tuy nhiên người ta vẫn ưu tiên ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất enzyme cellulase do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất sinh khối với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu con người có thể chủ động tạo ra được. Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn. Vi sinh vật sinh trưởng và phát triển với tốc độ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn. Hơn nữa enzyme sinh ra từ vi sinh vật có hoạt tính enzyme rất mạnh vượt xa các sinh vật khác. Vi sinh vật rất nhạy cảm với môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa khác. Do đó trong quá trình nuôi cấy có thể thay đổi mội số tác nhân nhằm cảm ứng khả năng sinh enzyme của chúng. Sinh khối sinh ra sau khi nhân giống có thể trộn với chất mang và sử dụng, bỏ qua một loạt quy trình tách chiết từ đó giảm công sức và giá thành sản xuất. Tuy vậy trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp. 1.2.4.4. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase
  • 51. nghiệp Trang 35 Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mình. Khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường như: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, nguồn cacbon, nguồn nitrogen. Nguồn cacbon: các loài vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn cacbon, có loài thì không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbon có thể đơn giản như các loại đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như glucan, tinh bột, cellulose. Ngoài ra, nguồn cacbon như nguồn cơ chất cảm ứng cho vi sinh vật sinh enzyme. Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cộng sự (1999) cho thấy, nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn cacbon thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12 là lactose; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cưa. Nguồn cacbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ưa ấm là vỏ lạc, rơm. Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn nitrogen. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhưng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong môi trường chứa nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men. Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 15 o C, các
  • 52. nghiệp Trang 36 loài ưa ấm thường sinh trưởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20 – 37 o C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50 o C. Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45 -55 o C và có thể chịu được nhiệt độ 65 – 80 o C. pH môi trường nuôi cấy ban đầu: pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trường ban đầu là 7,0; còn chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trường ban đầu là 6,7. Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở môi trường có pH ban đầu là 4,5 và 5,5; các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong khoảng pH môi trường ban đầu từ 6,0 - 7,0. Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lượng giống được tiếp vào ban đầu. Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Sharma và cộng sự (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. D04 lên 40 % so với đối chứng; còn Mg2+ làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92 %) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37 % so với đối chứng). 1.2.4.5. Ứng dụng của enzyme cellulase  Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc
  • 53. nghiệp Trang 37 Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam. Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20 % tổng giá trị kinh tế của ngành nông nghiệp. Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm như trứng, thịt, sữa cho thị trường mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho ngành trồng trọt. Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đói giảm nghèo, nâng cao đời sống cho người dân Việt Nam. Tuy nhiên, ngành nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn. Một trong những vấn đề cần được giải quyết hiện nay là làm thế nào để nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn cho môi trường xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con người. Do đó người ta hướng đến sử dụng phối hợp enzyme cellulase với các enzyme thủy phân khác nhau như pectinase, hemicellulase,... Trong quá trình ủ cỏ xanh có tác dụng phân giải thành tế bào thực vật, do đó tăng nguồn dinh dưỡng cho nhóm vi khuẩn lactobacilli lên men sinh acid lactic, ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật có hại khác. Trong chăn nuôi (với động vật ăn cỏ) nếu thức ăn có trộn thêm cellulose sẽ tăng sự tiêu hóa, sự hấp thu thức ăncho động vật, đặc biệt là động vật còn non có hệ tiêu hóa chưa hoàn chỉnh, do đó sẽ làm giảm chi phí thức ăn cho động vật và chúng sẽ tăng trọng nhanh hơn.  Tăng hiệu suất trích ly trong công nghệ thực phẩm Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những phương hướng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất xơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục. Cellulase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong. Cellulase kết hợp với các
  • 54. nghiệp Trang 38 hemicellulase, pectinase được ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ màng tế bào. Trong quá trình sản xuất nước cà rốt thường sử dụng cellulose xử lý ở giai đoạn dịch hóa. Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần đường, protein còn có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như cellulose và β-glucan, làm ảnh hưởng xấu đến quá trình lọc và chất lượng sản phẩm. Người ta thường sử dụng β-glucanase để loại bỏ những thành phần này. Các chế phẩm như Finizym 200L gồm các cellulase từ A.niger, β-glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã được sử dụng trong sản xuất bia. Ngoài ra, enzyme cellulase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola insolens được ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho bánh mỳ. Hệ cellulase từ Trichoderma reesei, A. niger được ứng dụng trong sản xuất fructooligosaccharide. Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng (prebiotic) được sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn. Cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực vật và từ cây thuốc được dễ dàng. Sử dụng cellulase phá vỡ cấu trúc thành tế bào thực vật mất vách cellulose trở thành tế bào trần. Sử dụng tế bào trần để nghiên cứu lai tế bào nhằm tạo các tế bào lai có những tính trạng mới theo mong muốn, tế bào trần còn được sử dụng để tiến hành các kỹ thuật chuyễn và nạp gen.  Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ Sử dụng cellulase xử lý nguyên liệu giàu cellulose trước khi lên men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5 %. Nhiều chế phẩm enzyme đã đựợc sử dụng trong ngành công nghiệp này như neutrase 0,5L có chứa hệ cellulase sử dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium sinh tổng hợp cellulase đựợc sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung môi hữu cơ, acetic acid, sản xuất acetone, butanol và isopropanol.
  • 55. nghiệp Trang 39  Thủy phân gỗ, các phế liệu giàu cellulose và sản xuất phân bón vi sinh Việc sử dụng enzyme quan trọng nhất trong công tác bảo vệ môi trường là sử dụng enzyme trong xử lý chất thải, chuyển các chất thải thành sản phẩm có ích. Trong nhiều năm qua cả ở thế giới và Việt Nam, các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh hoạt. Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam. Nhiều chế phẩm vi sinh trong đó có chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Trong đó, chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối chứng. Đồng thời, lượng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29 % và các chất dinh dưỡng cao hơn 10 % so với đối chứng. Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải được phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường.
  • 56. nghiệp Trang 40 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 01/04/2012-21/06/2012. 2.1.2. Địa điểm Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn mẫu Mụn dừa: Mụn dừa (hay mùn dừa - coco peat) được coi là loại phế phẩm nông nghiệp, được thu thập Thành phố Cao Lãnh tỉnh Đồng Tháp (ký hiệu: mẫu 1) và ở huyện Lai Vung (ký hiệu: mẫu 2). Vỏ tiêu: thu thập ở Bà Rịa Vũng Tàu (ký hiệu: mẫu 3). Khối lượng mỗi mẫu: 200g. 2.2.2. Hóa chất MgSO4.7H2O K2HPO4 KH2PO4 NH4NO3 FeCl3.6H2O
  • 57. nghiệp Trang 41 CaCl2 Hóa chất phân tích CMC Tannic acid Giấy lọc DNS Glucose Hóa chất khác: Cồn 70o , cồn 96o . Các hóa chất pha môi trường, NaCl, HCl 1N, NaOH 1N. 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Dụng cụ Ống nghiệm có nắp. Ống nghiệm không nắp. Đĩa petri. Cốc 100ml, cốc 250ml, cốc 1000ml Ống đong Erlen 250ml. Pipet 1ml, 2ml, 10ml. Pipet man 200µl. Đầu típ 200µl. Ống ly tâm.
  • 58. nghiệp Trang 42 Nhiệt kế. Đũa thủy tinh. Bao hấp, giấy gói, thun. 2.2.3.2. Thiết bị Tủ cấy vi sinh. Tủ ủ. Tủ lạnh Toshiba. Autolave. Máy đo quang. Máy ly tâm. Giấy quỳ. Cân phân tích. Bếp từ. Máy nước cất. 2.2.4. Thiết kế thí nghiệm 2.2.4.1. Mục tiêu Đồ án tốt nghiệp hướng đến 4 mục tiêu:  Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu.  Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập.  Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào,bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase.
  • 59. nghiệp Trang 43  Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn (hoặc xạ khuẩn) có enzyme cellulase có tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa. 2.2.4.2. Thiết kế thí nghiệm Để hoàn thành tất cả các mục tiêu, tôi tiến hành thiết kế các thí nghiệm cho từng mục tiêu. Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 1. Mụn dừa 1 Mụn dừa 2 Vỏ tiêu Tăng sinh trên môi trường chọn lọc chứa mẫu mụn dừa và vỏ tiêu và thành phần khoáng của môi trường BHM có tiến hành qua khâu xử lý nhiệt (Thí nghiệm 2.1.1.1.) Sàng lọc những mẫu có chứa quần thể vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose bằng phương pháp đục lỗ thạch (Thí nghiệm 2.1.1.2 ) Phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch chứa CMC để lựa chọn sơ bộ vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose (Thí nghiệm 2.1.1.3 ) 8 chủng vi sinh vật
  • 60. nghiệp Trang 44 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 2. 8 chủng vi sinh vật Khảo sát khả năng tiết enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC (cấy điểm) (Thí nghiệm 2.1.2.1) Khảo sát khả năng mọc trên môi trường thạch chứa giấy lọc (cấy ria) (Thí nghiệm 2.1.2.2 ) 5 chủng vi sinh vật phân giải cellulose
  • 61. nghiệp Trang 45 Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 3. Khả năng biến dưỡng citrate Nuôi cấy khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử (Thí nghiệm 2.1.3.1) Khảo sát một số phản ứng sinh hóa (Thí nghiệm 2.1.3.2 ) Khảo sát khuẩn lạc Nhuộm Gram Nhuộm bào tử Khả năng sinh Indol Khả năng sinh enzyme gellatinase 5 chủng vi sinh vật phân giải cellulose Bộ giống gồm 5 chủng
  • 62. nghiệp Trang 46 Hình 2.4: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 4 Khả năng thủy phân giấy lọc bằng nguyên tế bào vi khuẩn (Thí nghiệm 2.1.4.1.e) Tăng sinh trên môi trường lỏng chứa mụn dừa Bộ giống gồm 5 chủng Hoạt tính phân huỷ CMC Hoạt tính phân huỷ giấy lọc Khảo sát hoạt tính phân huỷ tannin của năm chủng ở pH7 và lắc 150 vòng/phút Đục lỗ thạch (thạch tannic acid) (Thí nghiệm 2.1.4.3.b) Hoạt tính enzyme tannase (Thí nghiệm 2.1.4.3.c) Khảo sát khả năng chịu tannic acid ở các nồng độ khác nhau (Thí nghiệm 2.1.4.3.d) Không lắc và lắc 150 vòng/phút pH môi trường: pH3, pH5, pH7, pH9 Đục lỗ thạch (Thí nghiệm 2.1.4.1.b ) Xác định hoạt tính CMCase (Thí nghiệm 2.1.4.1.c) Xác định hoạt tính FPase (Thí nghiệm 2.1.4.1.d) Các chủng có tiềm năng sử dụng ủ compost mụn dừa
  • 63. nghiệp Trang 47 2.2.5. Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm  Môi trường tăng sinh mẫu trên môi trường lỏng (kí hiệu:môi trường TS) (g/l) MgSO4.7H2O 0,2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0,05 CaCl2 0,02 pH = 7.0  Môi trường phân lập và giữ giống trên đĩa thạch (kí hiệu : môi trường PL): (g/l) MgSO4.7H2O 0,2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0,05 CaCl2 0,02 CMC 10 Agar 22 pH = 7.0
  • 64. nghiệp Trang 48  Môi trường định tính hoạt tính CMC của vi khuẩn (kí hiệu : môi trường ĐT): (g/l) CMC 10 Agar 22  Môi trường thử nghiệm khả năng mọc trên giấy lọc trên đĩa thạch (kí hiệu : môi trường M): (g/l) MgSO4.7H2O 0.2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0.05 CaCl2 0,02 Giấy lọc ½ đĩa thạch Agar 22 pH = 7.0  Môi trường tăng sinh chứa giấy lọc (kí hiệu : môi trường GL): (g/l) MgSO4.7H2O 0,2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0,05 CaCl2 0,02
  • 65. nghiệp Trang 49 Giấy lọc kích thước 1x6 cm pH = 7.0  Môi trường tăng sinh chứa Tannic acid 1 % (kí hiệu : môi trường TA): (g/l) MgSO4.7H2O 0,2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0,05 CaCl2 0,02 Tannic acid 1 pH = 7.0 2.3. Tiến hành thí nghiệm 2.3.1. Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu 2.3.1.1. Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Hình 2.5: Các mẫu mụn dừa thu thập
  • 66. nghiệp Trang 50 Tiến hành Trước khi tiến hành phân lập ta phải chuẩn bị mẫu. Tăng sinh 3 mẫu: 2 mẫu mụn dừa và 1 mẫu vỏ tiêu trên môi trường TS . Thực hiện: với mỗi mẫu pha 100ml môi trường tăng sinh TS mang đi hấp khử trùng 121 o C/15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung vào mỗi erlen 5 g mụn dừa và vỏ tiêu. Mang đi lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày, sau đó đun 80 o C/15 phút và lắc tiếp 2 ngày. Thu được 3 erlen 100 ml dung dịch chứa mẫu phân lập. Sơ đồ các bước tiến hành Hình 2.6: Sơ đồ tăng sinh vi sinh vật chịu nhiệt Hấp khử trùng 121o C/15phút Pha 100 ml môi trường TS Bổ sung 5 g mụn dừa (hoặc vỏ tiêu) Lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày Xử lý nhiệt 80 o C/15 phút/mẫu Mẫu tăng sinh
  • 67. nghiệp Trang 51 2.3.1.2. Thí nghiệm: Sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch Tiến hành Pha 100ml môi trường ĐT, đun và khấy đều để CMC và agar tan đều. Sau đó hấp khử trùng môi trường, đổ môi trường vào đĩa petri, để nguội và đục lỗ thạch. Dùng pipet vô trùng hút khoảng 0,2 ml dịch tăng sinh cho vào lỗ thạch. Ủ đĩa thạch ở 37 o C trong 1 ngày sau đó tiến hành đổ lugol. Sơ đồ các bước tiến hành Hình 2.7: Sơ đồ sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật phân huỷ cellulose Để nguội Ủ ở 37 o C trong 1 ngày Hấp khử trùng 121 o C/15 phút Pha 100ml môi trường ĐT Đổ môi trường vào đĩa petri đã hấp khử trùng Đục lỗ thạch (3 lỗ/đĩa) Cho 0,2 ml dịch tăng sinh vào lỗ thạch Đổ lugol
  • 68. nghiệp Trang 52 2.3.1.3. Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC Tiến hành Cách chuẩn bị đĩa môi trường phân lập: Sau khi pha môi trường PL vào bình tam giác thì tiến hành hấp khử trùng ở 121o C, 1 atm trong 15 phút cho cả môi trường và đĩa petri. Khi môi trường đã nguội khoảng 45 – 50 o C thì ta tiến hành đổ vào đĩa petri. Để môi trường nguội, ta lật ngược đĩa và đem ủ 30 o C trong 24 giờ để kiểm tra có bị nhiễm (nhiễm nấm men và nấm mốc) hay không. Chỉ sử dụng nếu đĩa không bị nhiễm. Chuẩn bị nước muối sinh lý: pha 100 ml nước muối sinh lý 0,85 % sau đó đem hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm, để nguội, sử dụng nước muối sinh lý để pha loãng mẫu. Tiến hành phân lập Sau khi tăng sinh mẫu xong , tiến hành pha loãng mẫu : Nồng độ pha loãng 10- 1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-5 10-7 Thể tích mẫu (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Thể tích nước muối sinh lý 0.85 % đã hấp khử trùng (ml) 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 Chọn 3 độ pha loãng 10-3 , 10-5 và 10-7 . Hút 0,1 ml mỗi độ pha loãng cho vào đĩa môi trường đã chuẩn bị ở trên, cấy trang cho đều và mặt thạch vừa khô rồi đem ủ ở 37 o C trong 3 ngày. Cấy chuyền: sau khi ủ theo dõi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau, mỗi khuẩn lạc cấy vào một đĩa riêng theo đường zigzac (đường cấy sau
  • 69. nghiệp Trang 53 chỉ chạm vào đường cấy trước một vài điểm), sau khi cấy xong một đường cấy phải hơ nóng đầu que cấy trên ngọn đèn cồn. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37 o C trong tủ ủ. Cứ như thế cho đến khi các khuẩn lạc rời đều thì kiểm tra dưới kính hiển vi thấy khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng, kích thước, khuẩn lạc rời là xem như đã thuần. Nếu mẫu thuần thì trữ mẫu. Nếu mẫu chưa thuần thì tiếp tục cấy đến khi thuần. Sơ đồ các bước tiến hành phân lập Hình 2.8: Sơ đồ phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch chứa CMC 2.3.2. Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập 2.3.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC Tiến hành Lật ngược đĩa Để nguội Hấp khử trùng 121o C/15phút Pha 300 ml môi trường PL Đổ môi trường vào đĩa petri đã hấp khử trùng Cấy trang đĩa bằng dịch tăng sinh đã pha loãng bằng nước muối sinh lý Ủ ở 37 o C trong 3 ngày Quan sát và cấy chuyền các chủng vi sinh vật

là ai Hỏi Đáp Là gì Học Tốt Tiếng anh Cellulose la gì

Bài Viết Liên Quan

Nước nào có dân số đông thứ 2 thế giới năm 2024
Nước nào có dân số đông thứ 2 thế giới năm 2024

mẹo hay
Bảng tương tác dạy toán tiểu học chức năng năm 2024
Bảng tương tác dạy toán tiểu học chức năng năm 2024

mẹo hay Học Tốt Học
Mức chi tiêu trung bình của người đi làm năm 2024
Mức chi tiêu trung bình của người đi làm năm 2024

mẹo hay
Vô hiệu hóa nút bixby trên note 9 năm 2024
Vô hiệu hóa nút bixby trên note 9 năm 2024

mẹo hay
Làm sao để không bị lỗi font chữ trong photoshop năm 2024
Làm sao để không bị lỗi font chữ trong photoshop năm 2024

mẹo hay Hỏi Đáp Làm sao
Cao đẳng sư phạm anh văn tiếng anh là gì năm 2024
Cao đẳng sư phạm anh văn tiếng anh là gì năm 2024

mẹo hay Hỏi Đáp Là gì Học Tốt Tiếng anh
Có gái tóc đỏ là người thuộc nước nào năm 2024
Có gái tóc đỏ là người thuộc nước nào năm 2024

mẹo hay Giới Tính Gái
Có các chế độ báo cáo thống kê nào năm 2024
Có các chế độ báo cáo thống kê nào năm 2024

mẹo hay
Ngân hàng chính sách xã hội chi nhánh thanh hóa năm 2024
Ngân hàng chính sách xã hội chi nhánh thanh hóa năm 2024

mẹo hay Học Tốt Sách Khoa Học Ngân hà
Cách nào đo lường app của đối thủ cạnh tranh năm 2024
Cách nào đo lường app của đối thủ cạnh tranh năm 2024

mẹo hay Mẹo Hay Cách
Bô quốc phòng bộ tư lệnh hóa học năm 2024
Bô quốc phòng bộ tư lệnh hóa học năm 2024

mẹo hay Học Tốt Học
Ngành chế biến thủy sản thi khối nào năm 2024
Ngành chế biến thủy sản thi khối nào năm 2024

mẹo hay
Hướng dẫn làm thẻ thanh toán quốc tế năm 2024
Hướng dẫn làm thẻ thanh toán quốc tế năm 2024

mẹo hay Mẹo Hay Hướng dẫn
Nhận biết các chất hóa học vô cơ lớp 11 năm 2024
Nhận biết các chất hóa học vô cơ lớp 11 năm 2024

mẹo hay Học Tốt Học
Lỗi không cài được win 8.1 trên trên máy tính năm 2024
Lỗi không cài được win 8.1 trên trên máy tính năm 2024

mẹo hay Công Nghệ Máy tính Máy
Coông ty tnhh acpa thực tập kế toán năm 2024
Coông ty tnhh acpa thực tập kế toán năm 2024

mẹo hay
Ôn tập ngữ văn lớp 6 học kì 2 năm 2024
Ôn tập ngữ văn lớp 6 học kì 2 năm 2024

mẹo hay Học Tốt Học
Những bài văn hay lớp 5 tả cảnh năm 2024
Những bài văn hay lớp 5 tả cảnh năm 2024

mẹo hay
Top 3 công ty diễn viên ở trung quốc năm 2024
Top 3 công ty diễn viên ở trung quốc năm 2024

mẹo hay Top List Top
Tìm văn phòng cho thuê tại hà nội năm 2024
Tìm văn phòng cho thuê tại hà nội năm 2024

mẹo hay

Quảng Cáo

Có thể bạn quan tâm

Sửa lỗi bị treo máy khi khởi động năm 2024
4 ngày trước . bởi ElegantMaple
Dầu cù là thái lan loại nào tốt năm 2024
4 ngày trước . bởi ProvincialOunce
Khắc phục lỗi chỉ pairing nhưng không kết nối android năm 2024
4 ngày trước . bởi IntractableStimulus
Bài tập nâng cao về giới hạn hàm số năm 2024
5 ngày trước . bởi AdvisoryRecourse
Top các kiểu tóc nam mùa hè 2023 năm 2024
5 ngày trước . bởi ShortWitchcraft
Hình xăm hoa văn đẹp ở bắp chân năm 2024
5 ngày trước . bởi WoollyDynamics
Câu nói hay truyền cảm hứng về môn hóa học năm 2024
5 ngày trước . bởi RockingCumin
Bật chức năng thanh toán trực tuyến bidv năm 2024
5 ngày trước . bởi ManagerialTransmission
Nhân mã hợp làm bạn với cung nào năm 2024
5 ngày trước . bởi LimitedStimulus
Bài văn số 2 lớp 9 đề 1 năm 2024
5 ngày trước . bởi SlidingAtheism

Toplist được quan tâm

#1
Top 9 toán lớp 6 bài 5 trang 17 18 19 2023
7 tháng trước
#2
Top 7 nội dung câu chuyện những con sếu bằng giấy 2023
7 tháng trước
#3
Top 13 tuổi quý mùi mua xe màu gì hợp 2023
7 tháng trước
#4
Top 5 vai ác luôn đối ta chảy nước dãi ba thước 2023
7 tháng trước
#5
Top 6 pháo hôi nam xứng tay xé giả thiếu gia kịch bản 2023
7 tháng trước
#6
Top 7 quy định về giao tiếp ứng xử với người bệnh 2023
7 tháng trước
#7
Top 8 moocgan phát hiện ra các quy luật di truyền khi nghiên cứu đối tượng nào sau đây 2023
7 tháng trước
#8
Top 10 trắc nghiệm văn tế nghĩa sĩ cần giuộc 2023
7 tháng trước
#9
Top 9 liên thông trái ngành đại học kinh tế 2023
7 tháng trước

Quảng cáo

Xem Nhiều

Tạo top up đăng ký thông tin cho web năm 2024
1 ngày trước . bởi SheepishEagerness
Văn bằng 2 đại học xã hội nhân văn năm 2024
2 ngày trước . bởi FearsomeDifferentiation
Các bài tập về sự điện li lớp 11 năm 2024
4 ngày trước . bởi Sixteen-year-oldSelf-confidence
172 hoàng văn thái thanh xuân hà nô i năm 2024
3 ngày trước . bởi BelovedOnslaught
785 bà triệu phường điện biên tp thanh hóa năm 2024
1 tuần trước . bởi AttainableCylinder
Sửa lỗi màn hình xanh win 10 memory management năm 2024
1 tuần trước . bởi QuintessentialHandshake
Bài tập phát âm tiếng anh có đáp án năm 2024
1 ngày trước . bởi CausticCondominium
316 lê văn sỷ phường 1 quận tân bình năm 2024
1 tuần trước . bởi AchingSeeder
Thời tiết hải phòng ngày mai thế nào năm 2024
1 tuần trước . bởi StonedCircus
Muốn chèn một công thức toán vào slide năm 2024
1 tuần trước . bởi SimultaneousAircraft

Quảng cáo

Chúng tôi

Điều khoản

Trợ giúp

Mạng xã hội

DMCA.com Protection Status
Bản quyền © 2021 jakhi.com Inc.