So sánh pcr và real time pcr

Việc phát minh ra phản ứng chuỗi polymerase (PCR) của Kary Mullis vào năm 1984 được coi là một cuộc cách mạng trong khoa học. Tuy nhiên, kết quả phản ứng PCR chỉ được biết sau khi hoàn thành và phải thực hiện một số kỹ thuật đi kèm khác như điện di hay đo OD (Optical density). Bên cạnh đó, kết quả ghi nhận được của phản ứng là nồng độ cuối cùng của sản phẩm PCR, trong khi sự thay đổi nồng độ trong quá trình phản ứng cũng như ảnh hưởng của lượng mẫu đầu vào đến kết quả không được ghi nhận.

Để khắc phục được những vấn đề này, PCR đã được cải tiến thành real-time PCR (hay PCR), đây được coi là một bước nhảy vọt về công nghệ vào cuối thế kỷ 20, giúp mở ra những ứng dụng mới vượt bậc cho các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới. Máy real-time PCR lần đầu tiên được thương mại hóa bởi Applied Biosystems vào năm 1996, công nghệ này nhanh chóng phát triển thành một thị trường cạnh tranh, hàng loạt các công ty kinh doanh sản phẩm sinh học cho ra mắt các dòng máy real-time PCR.

Về mặt định nghĩa, kỹ thuật real-time PCR cho phép biết được số lượng bản sao DNA mục tiêu tạo ra ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng bằng công nghệ huỳnh quang. Ngoài việc có thể xác định được sự có mặt của trình tự DNA mục tiêu (Real-time PCR định tính), qPCR còn có thể định lượng được DNA mục tiêu (qPCR định lượng) có trong mẫu ban đầu qua mỗi chu kỳ.

2. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật real-time PCR

Tương tự như PCR, kỹ thuật real-time PCR cũng bao gồm các thành phần cơ bản như dNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn, cặp mồi và dung dịch đệm. Điểm khác biệt đó là real-time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang để máy có thể phát hiện và đo được cường độ tín hiệu từ chất này. Khi phản ứng nhân bản xảy ra tới một chu kỳ nhất định, cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ bắt đầu có sự gia tăng rõ rệt và tương quan với số lượng bản sao DNA được tạo ra.

Kết quả được thể hiện dưới dạng biểu đồ quan sát được qua mỗi chu kỳ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về hiệu quả khuếch đại DNA mục tiêu. Real-time PCR yêu cầu có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ ống mẫu và cài chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả về sự biến đổi cường độ huỳnh quang.

Chu trình nhiệt của real-time PCR cũng có 3 giai đoạn cơ bản tương tự như PCR bao gồm:

– Giai đoạn biến tính: Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 94-950C, lúc này liên kết hydro giữa các bazơ trong sợi DNA mạch đôi bị phá vỡ, dẫn đến tạo thành 2 sợi đơn DNA. Mỗi sợi đơn này trở thành khuôn để tổng hợp mạch mới. Thời gian biến tính có thể tăng lên nếu thành phần khuôn có nhiều GC.

– Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-650C trong 20-40 giây để probe và mồi gắn lần lượt vào sợi DNA khuôn và bắt đầu quá trình tổng hợp mạch mới nhờ vào sự hoạt động của DNA polymerase.

– Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 720C, đây là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động tổng hợp mạch mới của DNA polymerase. Giai đoạn này không bắt buộc ở một số chu trình qPCR, do kỹ thuật này thường dùng khuếch đại các đoạn có trình tự ngắn hơn PCR, vào khoảng <200bp, do vậy chỉ cần hai bước biến tính và bắt cặp là đủ để khuếch đại đoạn gen mục tiêu trong phản ứng qPCR. Chu trình chỉ gồm 2 bước giúp tiết kiệm thời gian, nhanh chóng phát hiện và định lượng được DNA.

Các giai đoạn này được thực hiện thông qua sự luân chuyển nhiệt độ giữa các chu kỳ. Qua mỗi chu kỳ, tín hiệu huỳnh quang sẽ được ghi nhận có sự gia tăng tương ứng với lượng bản sao DNA nhân lên theo cấp số lũy thừa.

3. Thành phần của phản ứng real-time PCR

Khi thực hiện real-time PCR, các thành phần phản ứng sẽ được trộn với nhau trong tube và đặt trong máy real-time PCR để thực hiện quá trình nhân bản DNA. Thành phần phản ứng qPCR bao gồm: mẫu (khuôn DNA/RNA), mồi, chất huỳnh quang, đệm, DNA polymerase, nucleotide tự do (dNTP) và các chất hỗ trợ (nếu cần). Hiện nay có hai cách thức để chuẩn bị cho phản ứng qPCR, đó là phối trộn các thành phần đơn lẻ hoặc sử dụng qPCR mix (các thành phần được phối trộn sẵn thành một loại dung dịch)

3.1. Mẫu (khuôn DNA/RNA)

Thông thường, mẫu trước khi đưa vào phản ứng khuếch đại cần được xử lý mẫu và tách chiết DNA/RNA. Việc lấy mẫu cần đảm bảo lấy đúng vị trí, lấy đủ lượng mẫu cần thiết để đảm bảo kết quả của xét nghiệm qPCR. Nguồn mẫu hiện nay rất đa dạng như mẫu máu, mẫu tế bào nuôi cấy, vi khuẩn, huyễn dịch (huyền phù), mẫu quét bề mặt, mẫu dịch phết (y tế), … mỗi loại mẫu sẽ có cách xử lý khác nhau để đảm bảo mẫu đầu vào cho xét nghiệm PCR.

Sau khi xử lý mẫu, bước tách chiết DNA/RNA cần được thực hiện để thu nhận nguồn mẫu đầu vào chất lượng cho PCR. Hiện nay, có nhiều kỹ thuật tách chiết DNA/RNA được sử dụng như phổ biến, bao gồm:

– Tách thô: phương pháp này phá vỡ tế bào, giải phóng nucleic acid, không có bước phân lập hoàn toàn nucleic acid ra khỏi tạp chất.

– Phương pháp tủa: sử dụng phương pháp tủa DNA/RNA bằng hóa chất và lực ly tâm để phân tách phần lớn nucleic acid ra khỏi tạp chất. Một số hóa chất thường sử dụng là phenol/chloform, muối hay CTAB.

– Phương pháp dựa trên lực liên kết giữa DNA với phân tử silica: sử dụng lực liên kết giữa nucleic acid và hạt silica để phân lập nucleic acid ra khỏi tạp chất. Bao gồm phương pháp sử dụng cột silica (tách cột), hạt silica tự do (phương pháp Boom) và hạt từ bao phủ silica (tách máy tự động).

Trong đó phương pháp tách cột và hạt từ bao phủ silica gần đây đã được thương mại hóa thành các bộ sản phẩm dùng cho tách chiết DNA/RNA. Các bộ kit tách chiết hiện đang là giải pháp được sử dụng phổ biến với quy trình thực hiện đơn giản, nhanh chóng và tiện lợi. Các bộ kit thường khác nhau ở dung dịch đệm ly giải tương ứng với mục đích tách chiết từng loại mẫu khác nhau, giúp rút ngắn thời gian tách chiết, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch DNA/RNA cao.

3.2. Mồi (Primer)

Mồi bao gồm mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (revverse primer), là những đoạn oligonucleotide ngắn (20-30 bp) có trình tự ở đầu 5’ bắt cặp đặc hiệu với đầu 3’ của DNA mục tiêu. Ở giai đoạn bắt cặp, cặp mồi sẽ gắn tương ứng lên hai sợi đơn của DNA sau khi bị biến tính và khuếch đại đoạn trình tự nằm giữa hai mồi. Vị trí mồi gắn vào gen mục tiêu cũng là điểm khởi đầu để các DNA polymerase gắn vào và có thể thực hiển tổng hợp mạch bổ sung mới.

Do đó, mồi là chỉ tiêu quan trọng quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng PCR nên cần đáp ứng các yêu cầu sau:

– Về trình tự, cả hai mồi đều phải đặc trưng cho khuôn DNA mục tiêu, hạn chế tối thiểu trùng với các gen khác. Mồi xuôi và mồi ngược không có sự bắt cặp bổ sung (cross dimer), không tạo các cấu trúc thứ cấp khác như tự bắt cặp (self dimer) hay cấu trúc “kẹp tóc” (hairpin).

Bên cạnh đó, thành phần GC cũng nên được cân đối để đảm bảo sự bắt cặp, việc có mặt GC sẽ giúp mồi bám và kéo dài (nên có 1-2 G hoặc C ở đầu 3’), nhưng nếu có nhiều GC lặp đi lặp lại sẽ làm mồi bắt cặp không đặc hiệu (thường từ 3 G hoặc C ở đầu 3’). Hàm lượng GC phù hợp là khoảng từ 40-60 % để tránh sự bắt cặp mồi không đúng.

– Về nhiệt độ bắt cặp, mồi có thể bám tốt lên DNA khuôn khi ở nhiệt độ phù hợp, gọi là nhiệt độ bắt cặp (annealing Temperature-Ta), lúc này nhiệt độ giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây để hai mồi gắn vào sợi DNA. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với khuôn, nhưng cũng phải đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu. Trường hợp nhiệt độ Ta quá thấp thì sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều, trong khi quá cao có thể dẫn đến lượng sản phẩm PCR không được tạo ra.

Ta được tính dựa trên nhiệt độ nóng chảy của mồi (melting Temperature-Tm). Tm được định nghĩa là điểm nhiệt mà tại đó 50% sợi đôi DNA phân tách nhau và tạo sợi đơn, Ta thường thấp hơn Tm khoảng 3-5 oC. Nhiệt độ Tm của hai mồi không chênh lệch nhau quá 2oC, nhiệt độ chênh lệch quá 5oC có thể không thể tạo ra được sản phẩm. Công thức tính Tm như sau: Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T). Từ công thức tính Tm, Ta được tính như sau: Ta = 0.3 x Tm (Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9

– Về nồng độ, mồi thường được cho vào phản ứng PCR dao động từ 0,1-1M. Việc sử dụng mồi thông thường dựa trên khuyến cáo của nhà sản xuất hay hướng dẫn trong bộ kit PCR gọi là nồng độ mồi tiêu chuẩn và chỉ nên thay đổi khi cần. Nếu nồng độ mồi quá thấp thì sẽ không đảm bảo lượng mồi đủ để hoàn thành chu trình PCR, ngược lại nếu nồng độ quá cao thì dễ gây việc khuếch đại sản phẩm không đặc hiệu.

Việc thiết kế mồi có thể làm thủ công dựa trên các nguyên tắc trong thiết kế mồi, tuy nhiên cách này thường sẽ gặp khó khăn nếu có số lượng DNA khuôn nhiều, có rất nhiều thông số phải tính toán. Do vậy, hiện nay đã có thêm một số phần mềm, công cụ trực tuyến hỗ trợ hay có thể sử dụng trực tiếp để thiết kế mồi dựa trên trình tự DNA khuôn mẫu. Các công cụ này giúp người dùng chọn được trình tự cặp mồi tối ưu dựa trên các tham số xác định. Một số phần mềm, công cụ thiết kế mồi phổ biến là Primer 3, Primer-BLAST, FastPCR, …

3.3. Enzyme tổng hợp (DNA polymerase)

DNA polymerase là thành phần quan trọng trong phản ứng nhờ hoạt tính tổng hợp dạng chuỗi nhằm mục đích khuếch đại được trình tự mục tiêu. Hiện nay, Taq polymerase với hoạt tính chịu nhiệt kết hợp với công nghệ khởi động bằng gia nhiệt (Hot-start) được sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, nhược điểm của Taq là không có hoạt tính sửa sai exonuclease 3’-5’, do vậy có thể dẫn đến xảy ra khuếch đại trình tự sai. Vì vậy, nhằm khắc phục hạn chế của Taq, một số polymerase được cải tiến như Pfu với cơ chế sửa sai nên có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra khi khuếch đại.

Ngày nay, một số polymerase với hiệu suất cao có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA giúp gia tăng hiệu quả khuếch đại trong tạo dòng, gen mục tiêu dài hay giàu CG. Trong phản ứng PCR, polymerase thông thường được dùng khoảng 1-2 đơn vị IU (international unit) trong thể tích tổng là 50 µL, nếu mẫu có chất ức chế thì có thể tăng thêm lượng enzyme nhưng nếu tăng quá cao thì có thể tạo sản phẩm không đặc hiệu.

3.4. Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)

Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) là những đơn vị nucleotide riêng lẻ dùng để tổng hợp mạch mới trong phản ứng qPCR. dNTP bao gồm 4 loại là adenine (dATP), cytosine (dCTP), guanine (dGTP) và thymine (dTTP). Cấu tạo của dNTP đều bao gồm một loại base ở carbone vị trí số 1 (C1) và 3 phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbon số 5 (C5) và đây cũng vị trí dNTP gắn vào đầu 3’ của sợi bổ sung trên DNA khuôn. Năng lượng để phản ứng này xảy ra được lấy từ các liên kết phosphate giàu năng lượng của nhóm triphosphate.

Hiện nay, dNTP có thể được sử dụng theo nhiều cách, một là từng loại dNTP sẽ được bơm riêng lẻ vào ống phản ứng qPCR, hai là bốn loại dNTP được phối trộn lại thành dạng mix (dNTP mix) trước đó và cuối cùng dNTP là thành phần sẵn có trong qPCR mix bao gồm những thành phần khác mà người dùng chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn và nước là có thể chạy phản ứng qPCR.

Các dNTP hiện nay được tinh chế bằng phương pháp sắc ký hiệu năng lỏng (HPLC) và có độ tinh khiết ít nhất là 99,5%. Bốn loại dNTP đều được dùng với nồng độ giống nhau khi phối trộn cùng nhau hay dùng riêng lẻ, nồng độ cuối dao động trong khoảng 20-200 µM. Trong trường hợp gây đột biến ngẫu nhiên bằng qPCR thì có thể thay đổi nồng độ từng loại dNTP cho phù hợp và kết hợp Taq polymerase không có hoạt tính sửa sai.

3.5. Dung dịch đệm và nồng độ Mg2+

Dung dịch đệm tạo ra một môi trường phù hợp cho phản ứng qPCR diễn ra, đặc biệt là hoạt tính DNA polymerase được tối ưu. Đệm thường được sử dụng trong phản ứng qPCR là Tris-KCl với pH dao động từ 8-9 giúp hòa tan và ổn định DNA, ion K+ trong đệm Tris hỗ trợ cho hoạt động gắn mồi. Ngoài ra, muối ammonium sulfate (NH4)SO4 cũng có thể được sử dụng thay thế KCl trong dung dịch đệm, trong đó ion NH4+ có khả năng làm mất ổn định liên kết hydro giữa các cặp base bắt cặp sai, giúp hỗ trợ tăng cường tính đặc hiệu cho phản ứng qPCR.

MgCl2 là muối được thêm riêng lẻ hoặc phối trộn với đệm Tris nhằm bổ sung ion Mg2+ cho hoạt động của DNA polymerase. Nguyên nhân do DNA polymerase là một holoenzyme nên cần một cofactor gắn vào trung tâm hoạt động thì mới có hoạt tính và Mg2+ đóng vai trò là cofactor của enzyme này. Do đó, nếu quá ít Mg2+ thì DNA polymerase sẽ không hoạt động hoặc tổng hợp kém hiệu quả, còn nếu quá nhiều Mg2+ thì phản ứng PCR sẽ không đảm bảo độ đặc hiệu. Nồng độ MgCl2 sử dụng sẽ phụ thuộc nhiều vào DNA polymerase, dung dịch đệm, dao động từ khoảng 0,5 đến 3,5mM.

3.6. Chất phát huỳnh quang sử dụng trong Real-time PCR

Cơ chế phát huỳnh quang là điểm đặc trưng tạo nên sự khác biệt của qPCR và PCR. Nhờ vào hiện tượng phát xạ huỳnh quang của một số phân tử hoá học ở dạng có sẵn hay được thiết kế để bắt vào mục tiêu gen cần phát hiện, hệ thống chuyên dụng sẽ thu nhận và phân tích tín hiệu để trả ra kết quả định lượng gen mục tiêu. Hiện nay có hai cơ chế phát huỳnh quang chính được sử dụng đó là chất huỳnh quang gắn chèn và mẫu dò.

Chất huỳnh quang gắn chèn (Fluorescent Dye-based real-time PCR)

Chất huỳnh quang gắn chèn là những chất có ái lực cao với DNA mạch đôi. Khi mới bắt đầu phản ứng những chất này phân tán trong dung dịch và phát ra tín hiệu ở mức thấp. Sau đó, bản sao DNA bắt đầu được tạo ra thì chất này sẽ tập trung lại và gắn chèn vào sợi mạch đôi, dẫn đến tín hiệu phát huỳnh quang sẽ được tăng lên (Hình 1).

Như vậy càng nhiều sợi đôi DNA được tạo ra thì cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng lên theo. Các chất huỳnh quang gắn chèn phổ biến hiện nay như SYBR Green, EVA Green, EtBr,… và thường được sử dụng trong các ứng dụng phát hiện các đột biến hay xác định genotype.

Hình 1. Nguyên lý hoạt động chất huỳnh quang gắn chèn trong real-time PCR (https://app.biorender.com/)

Biểu đồ nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại

Một lưu ý quan trọng khi sử dụng chất huỳnh quang gắn chèn đó là sau bước khuếch đại thì cần thực hiện thêm bước phân tích nhiệt độ nóng chảy. Nguyên nhân là do chất huỳnh quang gắn chèn sẽ gắn vào bất kỳ phân tử DNA mạch đôi nào có mặt trong dung dịch mà không có cơ chế gắn đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu. Thế nên, nếu như mồi tạo “primer dimer” (hiện tượng mồi tự bắt cặp với nhau thay vì gắn với mạch khuôn) thì kết quả sẽ dễ dẫn đến kết luận là mẫu dương tính giả (khoảng 35-40 chu kỳ)

Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại được định nghĩa là tại một điểm nhiệt độ nhất định có 50% sợi đôi DNA bị biến tính hoàn toàn. Giá trị Tm của sản phẩm giúp xác định xem tín hiệu huỳnh quang thu nhận được từ phản ứng khuếch đại có phải là của sản phẩm mục tiêu hay do “primer dimer”. Tm sẽ phụ thuộc vào nồng độ GC và độ dài trình tự, do vậy Tm của “primer dimer” thường rất thấp và rất dễ phân biệt với Tm của sản phẩm PCR đặc hiệu. Do vậy, thiết lập phản ứng xác định Tm là cần thiết khi sử dụng chất huỳnh quang gắn chèn.

Phản ứng nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm Real-time PCR

Sau phản ứng real-time, sản phẩm PCR sẽ tiếp tục trải qua một chương trình xác định Tm. Chương trình phân tích Tm bắt đầu với việc nâng nhiệt lên 950C trong khoảng 15 giây để biến tính đồng loạt các sợi đôi DNA, sau đó hạ nhiệt xuống khoảng 55- 600C trong 15 giây để các sợi này gắn bổ sung lại. Đường cong nóng chảy của sản phẩm PCR sẽ bắt đầu được quan sát khi nâng nhiệt từ 550C đến 950C, ở mỗi mức tăng 0,1-0,50C/10 giây, tín hiệu huỳnh quang sẽ ngày càng giảm và máy sẽ ghi nhận lại.

Mức tăng nhiệt sẽ tùy thuộc vào loại chất huỳnh quang cũng như dòng máy qPCR sử dụng. Sau khi hoàn thành chương trình nhiệt, giá trị Tm ghi nhận được sẽ có dạng dốc nghiêng, do ở từng bước gia nhiệt, DNA sẽ biến tính dẫn đến cường độ huỳnh quang giảm dần. Tuy nhiên, Tm sẽ được xác định dễ dàng hơn thông qua việc chuyển đổi biểu đồ sang dạng “peak” (Hình 2).

Biểu đồ dạng này thể hiện giá trị mức độ giảm huỳnh quang (delta RFU) ứng với mức tăng nhiệt độ (delta T), do vậy gia nhiệt đến Tm thì tỷ lệ delta RFU/delta T sẽ gia tăng đột biến tạo một peak rõ rệt. Giá trị peak sẽ tương ứng Tm được xác định trên trục hoành của sản phẩm sau khuếch đại.

Hình 2. Đồ thị biểu diễn đường cong nóng chảy của sản phẩm PCR (Rentería-Solís et al., 2020)

Phân tích HRM (high-resolution melt curve)

HRM là kỹ thuật phân tích Tm có độ phân giải cao, giúp phát hiện và phân biệt các sản phẩm PCR có độ chênh lệch Tm thấp, nói cách khác phân tích HRM có khả năng xác định các biến thể trong trình tự gen (đột biến điểm hay SNPs).

Phân tích này diễn ra sau phản ứng khuếch đại và phần mềm máy cũng sẽ tự động xử lý dành riêng cho HRM. Vì HRM được theo dõi “real-time”, do vậy cũng sẽ đưa ra biểu đồ hình ảnh thực về các đặc điểm của DNA đang được thử nghiệm khi phản ứng xảy ra. Phân tích HRM là một giải pháp thay thế cho sàng lọc trình tự bằng biến tính sắc ký lỏng hiệu năng cao dHPLC của các biến thể gen mới. Một số thuốc nhuộm thương mại được sử dụng để thực hiện HRM là SYTO, Chromofy, LC Green, EvaGreen, …

So với các công nghệ phát hiện đột biến khác như giải trình tự, dHPLC và điện di gel gradient biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis – DGGE), HRM cung cấp một phương pháp dễ dàng hơn, ít tốn thời gian hơn và tiết kiệm chi phí. Bên cạnh đó, phân tích HRM làm giảm đáng kể khả năng nhiễm chéo từ phản ứng PCR trước. Sự nóng chảy của sản phẩm PCR HRM đang được sử dụng để xác định kiểu gen các biến thể lưỡng bội, phân tích methyl hóa DNA, xác định loài, định loại kháng nguyên bạch cầu người hay phát hiện đột biến.

Mẫu dò (Fluorescent Probe-based real-time PCR)

Mẫu dò (probe) là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có thể bắt cặp đặc hiệu với một đoạn trình tự trên DNA mục tiêu, bao gồm đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ gắn chất hấp phụ huỳnh quang (quencher). Khi cấu trúc của mẫu dò còn nguyên vẹn thì đầu quencher sẽ làm tắt tín hiệu huỳnh quang phát ra từ đầu reporter nếu khoảng cách hai đầu này đủ gần bởi cơ chế FRET, do dó chiều dài mẫu dò chỉ nên từ 18-22 nucleotide và quan trọng là reporter và quencher phải tương tích nhau về bước sóng kích thích và bước sóng phát huỳnh quang.

Ví dụ nếu reporter là FAM, TET, VIC thì quencher phù hợp là TAMRA, Cy3, Cy5 với BHQ2. Khi phản ứng nhân bản bắt đầu xảy ra, cụ thể là mẫu dò sẽ gắn lên sợi khuôn trước mồi và ở vị trí sau mồi theo chiều 5’à 3’, sau đó DNA polymerase khởi động quá trình tổng hợp sợi mới, khi gặp mẫu dò sẽ hoạt hóa hoạt tính exonuclease để cắt cấu trúc mẫu dò. Lúc này, đầu reporter của mẫu dò sẽ tách rời hoàn toàn với đầu quencher và phát huỳnh quang do không còn sự hấp phụ ánh sáng từ quencher.

Hệ thống máy real-time PCR sẽ ghi nhận tín hiệu từ reporter và hiển thị trên màn hình máy tính. Lượng DNA được khuếch đại càng nhiều, tín hiệu huỳnh quang thu được sẽ càng mạnh.

Hình 3. Nguyên lý hoạt động chất huỳnh quang mẫu dò trong real-time PCR (https://app.biorender.com/)

Taqman là mẫu dò phổ biến được sử dụng trong qPCR, mẫu dò này hoạt động dựa trên khả năng cắt exonuclease của Taq polymerase. Ngoài ra, còn có TaqMan MGB (minor groove binder) với cấu trúc đầu 3’ chứa một phân tử có khả năng bám vào rãnh xoắn nhỏ của DNA. Khi mẫu dò này bám vào trình tự đích, một rãnh nhỏ ngắn được hình thành trên DNA làm tăng Tm, dẫn đến mẫu dò bám chặt hơn hay nói cách khác mẫu dò vẫn bám chắc ở nhiệt độ Ta cần thiết cho mồi mà không cần tăng chiều dài (Hình 4).

Ngoài ra, còn có một số loại mẫu dò như Molecular beacon, Scorpion primer. Theo đó, Molecular beacon là một DNA mạch đơn dài 20 – 25 nu cũng được đánh dấu kép ở hai đầu như Taqman, ở trạng thái bình thường mẫu dò loại này tạo thành cấu trúc kẹp tóc (Hình 5). Việc thiết kế molecular beacon yêu cầu 4 – 6 nu ở hai đầu của nó phải tạo thành cấu trúc kẹp tóc, trong khi phần loop khi biến tính thành dạng sợi thẳng sẽ gắn bổ sung với DNA mục tiêu.

Ở bước gắn mồi của phản ứng PCR, phần loop của Molecular beacon bám vào trình tự đích của nó, làm cho phần thân (stem) biến tính. Lúc này, reporter và quencher tách xa nhau ra làm cho máy phát hiện được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ reporter. Số lượng trình tự đích qua từng chu kỳ phản ứng được thể hiện qua cường độ phát quang.

Trong khi đó, Scorpion primer là các phân tử hai chức năng, có mồi được gắn cộng hóa trị với mẫu dò. Phân tử này cũng chứa một chất phát quang reporter và một quencher dập tắt tín hiệu (Hình 6). Nguyên lý định lượng sử dụng Scorpion primer là giống với Taqman và molecular beacon, tuy nhiên cấu trúc mẫu dò này phức tạp và khó thiết kế hơn.

Hình 4. Chất huỳnh quang TaqMan MGB (https://www.elitechgroup.com/)Hình 5. Chất huỳnh quang Molecular Beacon (Artika et al., 2022)Hình 6. Chất huỳnh quang Scorpion primer (Artika et al., 2022)

3.7. Real-time PCR mix (qPCR mix)

Trước đây, phản ứng qPCR được phối trộn lại từ các thành phần riêng lẻ bao gồm Taq DNA polymerase, dung dịch đệm, MgCl2, dNTP và nước sinh học phân tử được cung cấp trong cùng một bộ sản phẩm, sau đó mới bổ sung các thành phần còn thiếu như mồi và chất huỳnh quang. Các thành phần sẽ được pha theo nồng độ được khuyến cáo bởi nhà sản xuất nhưng vẫn có thể linh hoạt thay đổi dựa trên nồng độ đề nghị để đạt hiệu quả cho phản ứng.

Bên cạnh đó, việc phối trộn đơn lẻ còn có ưu điểm là Taq polymerase sẽ được bảo quản tốt trong dung dịch glycerol có độ bền cao hơn do không bị đông và rã đông nhiều lần và có thể cắt giảm lượng enzyme sử dụng. Tuy nhiên, cũng giống như PCR, phản ứng real-time PCR được thiết lập từ các thành phần đơn lẻ sẽ cần nhiều thời gian và tăng sai số do thao tác. Do vậy, hiện nay mix cho phản ứng qPCR cũng đã được phát triển để đáp ứng đa dạng nhu cầu sử dụng.

Real-time PCR mix là hỗn hợp chứa các thành phần cần thiết cho phản ứng real-time PCR với nồng độ đậm đặc (thường là 2X hay 5X). Tương tự PCR, thành phần real-time PCR mix về cơ bản bao gồm: polymerase, dNTP, Mg2+ và đệm tối ưu phản ứng. Khi sử dụng thì ngoài việc cho khuôn DNA và mồi như PCR thì chất phát huỳnh quang (chất huỳnh quang gắn chèn hoặc probe) sẽ được thêm vào mix để thực hiện phản ứng.

Trước đây, real-time PCR mix chia làm hai loại chính: bổ sung SYBR Green và bổ sung probe. SYBR Green là chất phát huỳnh quang gắn chèn được sử dụng phổ biến trong qPCR, chất này được cho vào trong mix sẵn, người dùng chỉ cần bổ sung cặp mồi và mẫu là có thể tiến hành qPCR. Đối với probe, người dùng phải thiết kế probe sao cho trình tự probe bắt cặp với gen đích trước mồi và nhiệt độ bắt cặp phải cao hơn mồi từ 8-100C.

Các thành phần trong mix được thay đổi linh hoạt để phù hợp với từng loại real-time PCR cũng như tác nhân mục tiêu. Sự cải tiến và tối ưu hóa real-time PCR mix sẽ tương ứng với sự phát triển của kỹ thuật này và đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càng gia tăng. Cụ thể như các bộ kit để chẩn đoán một số tác nhân gây các bệnh truyền nhiễm, các bộ kit real-time PCR cung cấp các mix có sẵn mồi-probe đã được thiết kế đặc hiệu cho vùng gen của tác nhân nhằm rút ngắn thời gian xét nghiệm mà vẫn mang lại độ chính xác cao.

Ngoài kỹ thuật qPCR truyền thống thì hiện nay các kit đã cải tiến để ứng dụng được trên nhiều kỹ thuật như multiplex qPCR hay RT-qPCR. Tương tự như multiplex PCR mix, multiple qPCR mix chỉ khác việc bổ sung probe hay chất huỳnh quang gắn chèn cho việc đọc tín hiệu huỳnh quang. Các mix của kỹ thuật này thường mang nhiều đặc tính như sử dụng cho đa tác nhân (2-4 tác nhân), các chất huỳnh quang được tối ưu để giảm thiểu sự nhiễu tín hiệu thu được giữa các kênh màu (Cross-talk) cũng như độ nhạy tương đương qPCR singleplex.

Việc thực hiện multiplex qPCR kết hợp mix pha sẵn sẽ giúp tiết kiệm thời gian khi thiết lập phản ứng và dễ dàng đối chiếu phân tích kết quả. Ngoài các multiplex qPCR mix sử dụng chung cho các loại tác nhân nói chung thì hiện nay một số sản phẩm mix được sản xuất riêng cho việc phát hiện và định lượng các tác nhân cụ thể. Với những loại mix này, trong thành phần đã bổ sung các cặp mồi và probe được thiết kế đảm bảo sự bắt cặp đặc hiệu với vùng gen nhất định của tác nhân, như vậy khi sử dụng người dùng chỉ cần bổ sung khuôn mẫu (DNA/RNA).

Đối với kỹ thuật Quantitative reverse transcripton (RT-qPCR), hiện nay có hai mix phổ biến đó là One-step và two-step. Trước đây, kỹ thuật RT-qPCR sẽ trải qua hai bước riêng biệt đó là tổng hợp cDNA và real-time PCR cùng với việc sử dụng hai mix tương ứng kèm theo (two-step). Ưu điểm đó là thành phần mỗi loại mix sẽ tối ưu cho phản ứng và có thể trữ RNA sau khi kết thúc phản ứng. Tuy nhiên, việc thực hiện lần lượt từng phản ứng sẽ mất thời gian và nhiều thao tác thực hiện, nguy cơ nhiễm cao và nhất là khó ứng dụng trong chẩn đoán bệnh cần xác định tác nhân nhanh chóng.

Trong khi đó, mix one-step RT-qPCR cho phép trực tiếp thực hiện kết hợp hai phản ứng tổng hợp cDNA và real-time PCR trong cùng ống phản ứng, giúp tiết kiệm thời gian và hạn chế thao tác gây nhiễm, tuy nhiên khi gộp phản ứng thì các thành phần sẽ không được hoạt động tối ưu cho từng loại phản ứng, ví dụ như thành phần đệm phải dùng chung cho Taq polymerase và reverse transcriptase hay không thể lưu trữ RNA lại sau khi phản ứng kết thúc. Do vậy tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà lựa chọn mix RT-qPCR phù hợp.

Bên cạnh tối ưu hóa các thành phần phản ứng, nhà sản xuất mix qPCR còn bổ sung một số chất tăng cường (enhancer) và chất ổn định phản ứng (stabilizer). Trong khi, chất tăng cường hỗ trợ cho việc nhân bản những vùng gen khó (giàu GC) hoặc khi mẫu DNA có chứa chất ức chế thì chất ổn định được bổ sung nhằm bảo vệ hoạt động của Taq polymerase sau tái rã đông nhiều lần.

Ngoài ra, tùy dòng máy mà trong thành phần mix sẽ có thêm chất huỳnh quang bị động (passive reference dye) là ROX (6-corboxy-X-rhodmine). Khác với SYBR Green hay probe, tín hiệu huỳnh quang từ ROX gọi là “bị động” đó là do tín hiệu từ chất này không phản ánh sự khuếch đại DNA mục tiêu mà tín hiệu thu nhận được là từ bất kỳ thứ gì khác có thể làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang tổng (mồi, probe, tuýp, …). Tín hiệu từ ROX sẽ được thu nhận bằng một kênh màu riêng và song song độc lập với tín hiệu của sản phẩm khuếch đại.

Việc dùng ROX sẽ giúp chuẩn hóa tín hiệu huỳnh quang, tránh cường độ tín hiệu huỳnh quang nền ảnh hưởng sai lệch đến tín hiệu huỳnh quang thật sự của sản phẩm khuếch đại đồng thời đảm bảo khả năng lặp lại thí nghiệm giữa các tuýp mẫu. Việc lựa chọn mix có ROX cần được chú ý phải phù hợp với loại máy qPCR đang sử dụng để tránh làm ảnh hưởng đến kết quả đo thu nhận được.

Hầu hết các mix hiện nay đều ở dạng lỏng, tiện lợi cho việc sử dụng. Tuy nhiên, nhà sản xuất gặp một số khó khăn trong việc bảo quản và vận chuyển các ống mix lỏng, dễ gặp tình trạng bung nắp hay rò rỉ dung dịch do rơi vỡ. Bên cạnh đó, mix lỏng yêu cầu trữ trong thiết bị chuyên dụng ở nhiệt độ từ -200C đến -700C (nếu cần trữ trong thời gian dài) để duy trì hoạt tính, do vậy việc này mặc nhiên trở thành áp lực về chi phí bảo quản không chỉ trong sử dụng mà cả vận chuyển cho nhà sản xuất và người sử dụng.

Do vậy, công nghệ đông khô hay gần đây là sấy khô đang bước đầu được ứng dụng vào kỹ thuật qPCR. Đông khô là một quá trình khử nước ở nhiệt độ thấp chủ yếu được sử dụng để ổn định các dược chất sinh học không bền với nhiệt có trong dung dịch nước [Hansen et al., 2015].

Tuy nhiên, máy đông khô hiện nay vẫn là thiết bị đắt tiền nên khó khăn về chi phí cho các phòng thí nghiệm. Ngoài ra, quá trình đông khô sử dụng nhiệt độ cao để bay hơi hoàn toàn hơi nước có thể gây hỏng mix, đặc biệt là hoạt tính của poplymerase. Với công nghệ sấy khô, một tủ sấy bình thường ở các phòng thí nghiệm có thể đáp ứng làm khô mix ở khoảng 700C. Việc sử dụng mix khô cũng đã được nghiên cứu chứng minh tính ổn định và hiệu quả tương đương mix lỏng.

Những cải tiến về mix qPCR hiện nay đều hướng đến việc thiết lập phản ứng hiệu quả, nhanh chóng, tiết kiệm về mặt chi phí và thời gian. Đối với những phòng thí nghiệm trường học hay trung tâm, thông thường sẽ sử dụng loại thành phần đơn lẻ để tối ưu hóa quy trình nghiên cứu, còn riêng đối với các phòng thí nghiệm dịch vụ hay bệnh viện, thời gian và độ tái lặp của quy trình là cực kỳ quan trọng. Chính vì vậy, đại đa số các bệnh viện, trung tâm dịch vụ sẽ ưu tiên dùng qPCR mix thay vì các thành phần phản ứng đơn lẻ như trước đây.

4. Một số thuật ngữ trong phân tích kết quả real-time PCR

Đối với kỹ thuật qPCR, do tính chất “real-time” nên người làm có thể theo dõi quá trình phản ứng diễn ra được thể hiện trên hệ thống máy tính. Tín hiệu huỳnh quang thu nhận được sẽ chuyển đổi thành dạng biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại, biểu đồ này sẽ bao gồm các thông số về tín hiệu nền (background), đường nền (baseline) và chu kỳ ngưỡng (cycle threshold- Ct) (Hình 7). Trong đó:

Tín hiệu nền (Background): là các tín hiệu huỳnh quang nền được tạo thành không liên quan đến phản ứng real-time PCR. Tín hiệu này thường do đầu reporter của probe phát ra, về lý thuyết thì ở điều kiện bình thường quencher sẽ hấp thụ hết tín hiệu do reporter phát ra, nhưng thực tế quencher không thể hấp thụ 100% tín hiệu do reporter phát ra nên trong hầu hết các phản ứng real-time PCR đều xuất hiện tín hiệu nền. Ngoài ra, mỗi loại probe khác nhau, nhà sản xuất khác nhau thì tín hiệu nền của từng probe sẽ khác nhau.

Ngày nay, các hãng tổng hợp probe cũng đã thiết kế ra nhiều cách để hạn chế tín hiệu nền này như dual quencher,… Về trường hợp sử dụng SYBR Green, ban đầu khi chưa có trình tự mục tiêu thì chất này vẫn phát huỳnh quang trong dung dịch tuy nhiên do phân tán nên cường độ sẽ yếu và tạo thành tín hiệu nền cho phản ứng. Những chu kỳ đầu của real-time, nồng độ ban đầu của mẫu thấp nên cường độ huỳnh quang phát ra không đủ để máy real-time PCR có thể ghi nhận được và giai đoạn này thường chỉ ghi nhận được tín hiệu nền của mẫu.

Đường nền (Baseline): là đường biểu diễn mức độ tín hiệu trong suốt những chu kỳ đầu của real-time PCR. Việc thiết lập baseline là bước quan trọng trong phân tích kết quả real-time PCR do baseline không cố định, giá trị baseline sẽ ảnh hưởng nhiều đến kết quả cuối cùng. Nếu điều chỉnh giá trị baseline quá thấp, kết quả sẽ rất dễ thu nhận tín hiệu nhiễu (dương tính giả), ngược lại giá trị baseline quá cao, kết quả sẽ có độ chính xác thấp vì bỏ qua các mẫu dương yếu (âm tính giả). Vì vậy, baseline nên được điều chỉnh khoảng 5% so với giá trị tín hiệu huỳnh quang cao nhất của mẫu

Ngưỡng (Threshold): là mức tín hiệu mà ở đó nó phản ánh sự gia tăng tín hiệu có ý nghĩa về mặt thống kê, giúp phân biệt tín hiệu khuếch đại vượt qua khỏi tín hiệu nền. Người ta thường thiết lập giá trị ngưỡng dựa vào đường nền hoặc mức tín hiệu thực tế của mẫu. Giá trị ngưỡng được thiết lập tương tự như baseline.

Chu kỳ ngưỡng (Ct – threshold cycle): là số chu kỳ mà tại điểm đó tín hiệu huỳnh quang của phản ứng vượt lên cắt đường ngưỡng, thay đổi từ âm tính (không thể phát hiện được) sang dương tính (có thể phát hiện được). Giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) phản ánh lượng gen quan tâm trong giai đoạn đầu của phản ứng và tỷ lệ nghịch với mức biểu hiện tương đối ban đầu của gen quan tâm. Nếu giá trị Ct càng nhỏ có nghĩa là nồng độ gen quan tâm ban đầu càng lớn và ngược lại.

Chất huỳnh quang bị động (Passive reference dye): thường được sử dụng trong real-time PCR để chuẩn hóa tín hiệu huỳnh quang của reporter và hiệu chỉnh sự dao động về tín hiệu huỳnh quang không tạo thành do phản ứng PCR giữa các giếng. Không phải máy nào cũng có chế độ này do vậy cần xem kỹ thông tin của máy để chọn loại hóa chất sao cho phù hợp.

Giá trị ngưỡng kỹ thuật (The cycle cut-off value): giá trị này thường được xác định đối với xét nghiệm định tính, dựa vào giới hạn phát hiện của phương pháp xét nghiệm (LOD). Trước khi xét nghiệm, cần phải xác định khoảng tuyến tính của phương pháp dựa trên giới hạn trên và giới hạn dưới của phương pháp. Giới hạn dưới là nồng độ tối thiểu mà phương pháp có thể phát hiện được một cách chính xác, dựa vào đây người ta sẽ thiết lập giá trị Ct cut-off.

Thông thường các chu trình nhiệt của một phản ứng real-time PCR sẽ được cài đặt từ 40-45 chu kỳ. Những mẫu xuất hiện Ct được coi là dương tính, không xuất hiện Ct được coi là âm tính. Các kit xét nghiệm trên thị trường hiện nay thường có giá trị Ct cut-off trong khoảng 35-37. Những mẫu nào có giá trị Ct nhỏ hơn hoặc bằng giá trị Ct cut-off được coi là có độ tin cậy cao, còn mẫu nào có giá trị Ct lớn hơn Ct cut-off được coi là nghi ngờ cần chạy lại để xác định hoặc kết luận âm tính.

Các mẫu dương tính muộn có Ct từ 38-45, được đánh giá là dương tính giả hoặc nồng độ quá thấp bộ kit không thể phát hiện được, nguyên nhân có thể do sự bắt cặp không đặc hiệu, nhiễm chéo hoặc sự thoái hóa của Taq polymerase, probe,…

Việc đọc kết quả real time PCR sẽ tùy vào phương pháp sử dụng (loại mẫu dò, loại chứng nội hay loại máy sử dụng).

Hình 7. Đường biểu diễn cường độ tín hiệu huỳnh quang trong real-time PCR (https://geneticeducation.co.in/)

Đường chuẩn (Standard curve) Khác với PCR, ngoài hệ thống mẫu đối chứng, xét nghiệm qPCR còn có một thông số để kiểm soát thao tác và hiệu quả khuếch đại, đó là đường chuẩn. Theo định nghĩa, đường chuẩn được xây dựng từ giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) của một dãy các ống chứa DNA có nồng độ tuyến tính đã được xác định trước (thường pha loãng theo bậc 10 như 101, 102, 103,…). Nồng độ được chọn cho việc xây dựng đường chuẩn phải bao quát được nồng độ dự kiến của DNA mục tiêu có trong mẫu thử nghiệm. Đường chuẩn bao gồm trục x (nồng độ chuẩn) và trục y (giá trị Ct).

Các thông số của đường chuẩn như hệ số tuyến tính (R2), hiệu suất khuếch đại (E%) và độ dốc (slope) được máy tính toán dựa trên kết quả ghi nhận thực tế, giúp xác định chất lượng của một phản ứng qPCR (Hình 8), cụ thể:

– Hệ số tuyến tính (R2): phản ánh mức độ tuyến tính của các giá trị trong đường chuẩn, R2 lý tưởng là tiến đến 1, thực tế giá trị tối đa chỉ tới mức 0,999.

– Hiệu suất khuếch đại (E%): phản ánh mức độ hiệu quả của phản ứng khuếch đại. E% lý tưởng là 100%, đó là khi DNA mục tiêu tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt trong giai đoạn lũy thừa của phản ứng. Tuy nhiên trên thực tế, hiệu quả khuếch đại sẽ có sự sai lệch so với giá trị lý tưởng, cụ thể dao động trong khoảng 90-110%.

Nếu E thấp, nguyên do có thể là độ nhạy của mồi chưa cao hay phản ứng bị ức chế, nếu E cao có thể là mồi bắt cặp đặc hiệu. Một số yếu tố về thành phần như chiều dài gen đích, thành phần GC, các cấu trúc thứ cấp hình thành hay thao tác người thực hiện sẽ ảnh hưởng đến E%.

Trong nghiên cứu, thao tác pha loãng mẫu chuẩn cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất. Ví dụ, khi pha loãng mẫu chuẩn từ nồng độ cao đến thấp sẽ dễ gặp phải trường hợp thể tích mẫu nồng độ cao trước đó sẽ còn dính ở đầu tip dẫn đến lượng DNA thực tế ở các ống pha loãng sau đó sẽ có cao hơn dự kiến, do vậy E có thể cao hơn 100%. Trường hợp ngược lại nếu khi dung dịch không được đẩy ra hết cũng làm giảm giá trị E.

– Độ dốc (slope): được coi là thước đo hiệu suất khuếch đại. Nói cách khác đường chuẩn được xây dựng với các mẫu chuẩn nếu cách nhau qua độ pha loãng hệ số 10 thì hiệu quả khuếch đại E được tính theo công thức 10-1/slope với slope chính là độ đốc của đường biểu diễn chuẩn. Với hiệu quả lý tưởng là sản phẩm bản sao tăng lên gấp đôi so với khuôn ban đầu thì 10-1/slope = 2, như vậy slope lý tưởng là -3,32 tương đương E=100%. Tuy nhiên, thực tế khó có thể đạt được điều kiện như vậy, do đó slope thường dao động trong khoảng từ -3,58 đến -3,10.

Sau phản ứng, dựa vào phương trình y=ax+b của đường chuẩn sẽ giúp xác định được nồng độ DNA mục tiêu có trong mẫu. Như vậy đường chuẩn là một thông số để xác định hàm lượng bản sao DNA có trong mẫu và đánh giá hiệu quả của phản ứng khuếch đại. Hiện nay, trên thị trường một số kit qPCR đã cung cấp sẵn các ống nồng độ chuẩn để đảm bảo việc xây dựng đường chuẩn chính xác, không bị ảnh hưởng nhiều bởi thao tác người thực hiện.

Hình 8. Đồ thị phân tích cường độ tín hiệu huỳnh quang và đường chuẩn (https://www.merckmillipore.com/)

5. Các biến thể của kỹ thuật real-time PCR

Kỹ thuật real-time PCR hiện nay được sử dụng phổ biến để xác định sự hiện diện hay đo tải lượng của tác nhân mục tiêu (vi rút, vi khuẩn,…) thông qua phát hiện vật liệu di truyền của chúng là DNA hay RNA. Trong bài viết này sẽ đề cập đến các kỹ thuật real-time bao gồm qPCR định tính, qPCR định lượng, multiplex RT-qPCR và droplet digital PCR

5.1. Real-time PCR định tính

Kỹ thuật qPCR định tính tương tự PCR, dùng để xác nhận chính xác và nhanh chóng sự có mặt của tác nhân gây bệnh được nghi ngờ có trong mẫu bệnh phẩm, đặc biệt là bệnh truyền nhiễm, giúp hạn chế sự lây lan bệnh trong cộng đồng. Tuy nhiên, điểm khác biệt là phân tích đường cường độ tín hiệu huỳnh quang ngay trên máy tính mà không cần thực hiện điện di như PCR, điều này giúp việc trả kết quả nhanh chóng và kịp thời tìm ra nguyên nhân gây bệnh.

Với qPCR định tính, thường sử dụng chất huỳnh quang gắn chèn (thường là SYBR Green) hay probe (thường là Taqman) tùy vào điều kiện kinh phí của người sử dụng. Sau phản ứng, nếu đường tín hiệu cường độ huỳnh quang của gen mục tiêu vượt qua tín hiệu nền thì xác nhận là có sự hiện diện của tác nhân cần kiểm tra và ngược lại. Giá trị Ct sớm hay muộn phản ánh số lượng bản DNA ban đầu giúp dự đoán tình trạng bệnh do tác nhân mục tiêu gây ra.

Trong điều kiện lượng mẫu đầu vào là như nhau, mẫu có Ct nhỏ hơn thì sẽ có hàm lượng DNA cao hơn. Tuy nhiên trong thực tế thì khó có thể khẳng định lượng mẫu đầu vào là như nhau, vì vậy cần phải có giá trị Ct tham chiếu của gen chứng nội (IC), việc so sánh sẽ diễn ra gián tiếp thông qua việc so sánh với IC. Hiện nay trên thị trường đã có nhiều bộ kit qPCR định tính một số tác nhân gây bệnh truyền nhiễm phổ biến như HBV, HCV, HPV,… cung cấp giải pháp hữu ích cho việc chẩn đoán bệnh.

5.2 Real-time PCR định lượng

Khác với qPCR định tính chỉ giúp xác định sự hiện diện của tác nhân, kỹ thuật qPCR định lượng sẽ bổ sung thêm chức năng xác định chính xác số lượng DNA mục tiêu có trong mẫu. Kỹ thuật này yêu cầu xây dựng đường chuẩn dựa vào giá trị Ct và dãy nồng độ DNA đã biết trước. Nồng độ DNA mục tiêu sẽ được xác định thông qua đường chuẩn, do vậy các thông số đường chuẩn phải đạt yêu cầu để phản ánh độ tin cậy cũng như chất lượng kết quả xét nghiệm của qPCR định lượng.

5.3. Quantitative multiplex reverse transcription PCR (Multiplex RT-qPCR)

Hiện nay đây là kỹ thuật khả phổ biến được sử dụng trong nghiên cứu về chức năng gene, cụ thể kỹ thuật này cho phép đo lường đồng thời sự hiện diện và định lượng mRNA của nhiều gen khác nhau trong một mẫu.

Nếu phân cắt nghĩa thì đây là kỹ thuật kết hợp của multiplex, reverse transcription và real-time PCR. Trong đó, “multiplex” dùng để nói đến phản ứng khuếch đại từ hai gen đích trở lên trong cùng một phản ứng (có thể trên một nền mẫu hay nhiều nền mẫu), còn “reverse transcription” (RT) là kỹ thuật dùng để chuyển đổi RNA sợi khuôn thành sợi DNA bổ sung (complemantary DNA- cDNA) được thực hiện bởi enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) và mồi cho trình tự RNA.

Như vậy, nguyên tắc của kỹ thuật multiplex RT – qPCR là đầu tiên sử dụng các mồi RT (những đoạn mồi ngắn gắn với sợi khuôn mRNA) để khởi động quá trình phiên mã ngược mRNA thành sợi cDNA. Sau đó, hỗn hợp các cặp mồi khác nhau được sử dụng để nhân bản các đoạn cDNA của các gene cần xác định. Cuối cùng, qPCR sử dụng probe giúp định lượng số bản sao của các đoạn cDNA để xác định số lượng mRNA ban đầu trong mẫu.

Kỹ thuật kết hợp multiplex RT-qPCR là một công cụ hữu ích trong phát hiện và định lượng đồng thời sự hiện diện của nhiều mRNA mục tiêu khác nhau trong một mẫu, giúp giảm thời gian và chi phí so với việc thực hiện với từng trình tự mục tiêu khác nhau.

Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật multiplex RT-qPCR đó là việc thiết kế mồi/probe dùng dể nhân bản các trình tự gene mục tiêu khác nhau phải đảm bảo độ đặc hiệu, tránh hiện tượng mồi tương tác với nhau hay gắn không đặc hiệu. Bên cạnh đó, kỹ thuật kết hợp này đòi hỏi các thông số của quá trình nhân bản như nhiệt độ, thời gian phản ứng, nồng độ hóa chất, … phải được khảo sát để đảm bảo tính chính xác của kết quả.

Hiện nay, kỹ thuật multiplex RT-qPCR được sử dụng rộng rãi trong các bộ kit để chẩn đoán bệnh. Các bộ kit này được thiết kế để phát hiện và định lượng đồng thời nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau trong một hay nhiều nền mẫu bệnh phẩm, giúp hỗ trợ bác sĩ đưa ra phương án điều trị phù hợp và ngăn ngừa dịch bệnh lây lan.

Một số bệnh được ứng dụng kỹ thuật trong các bộ kit chẩn như kit chẩn đoán virus cúm loại A/B (Influenza virus type A/B) ở cúm gia cầm (TopSPEC®Influenza virus A/B RT-qPCR KIT), đây là bộ kit xét nghiệm cho phép định tính chính xác và phát hiện nhanh tác nhân gây cúm gia cầm trên nhiều nền mẫu khác nhau. Bộ kit được thiết kế kết hợp các bước trong một lần làm (onestep) nên tổng thời gian trung bình cho việc phát hiện tác nhân trên toàn bộ quy trình là 2 giờ, giúp chẩn đoán sớm tác nhân và đưa ra các biện pháp điều trị cũng như cách ly cá thể bệnh sớm nhất.

Một số virus gây bệnh trên thủy sản như YHV (Yellow head virus), TSV (Taura syndrrome inPenaeus vannamei) và IMNV (infectious myonecrosis virus) đều có vật chất di truyền là mRNA nên có thể được phát hiện cùng lúc trong môi trường nuôi trồng khi sử dụng bộ kit TopSPEC® YHV/TSV/IMNV Onestep RT-qPCR KIT.

Ở người, kỹ thuật này cũng đã được ứng dụng trong các bộ kit chẩn đoán SARS-CoV-2, điển hình là bộ kit của ScienCell (SCVMPD) được thiết kế để phát hiện sự hiện diện của SARS-CoV-2 trong các mẫu bệnh phẩm đường hô hấp và mẫu huyết thanh. Thành phần chứa mồi/probe khuếch đại 3 trình tự mục tiêu N1-FAM, N2-FAM và RP-HEX. Trong số đó, N1-FAM và N2-FAM nhắm mục tiêu vào hai vùng trên gen nucleocapsid (N) của SARS-CoV-2. RP-HEX nhắm vào exon 1 của gen RPP30 ở người và đóng vai trò kiểm soát để đánh giá chất lượng mẫu.

5.4. Droplet digital PCR (ddPCR)

Kỹ thuật real-time PCR có thể định lượng trình tự mục tiêu có trong mẫu, tuy nhiên chỉ ở mức tương đối do hàm lượng bản sao được xác định phụ thuộc vào đường chuẩn, mà chính xác là thao tác người thực hiện, do vậy kết quả có thể gây sai lệch và không đảm bảo độ chính xác cao. Droplet digital PCR (dddPCR) được coi là kỹ thuật thuộc thế hệ mới do được cải tiến từ real-time PCR cho phép định lượng chính xác bản sao trình tự mục tiêu sau khi kết thúc quá trình thực hiện.

Về cơ bản, ddPCR cũng giống với qPCR về thành phần phản ứng bao gồm mix, mồi, probe và khuôn DNA nhưng thay vì thể tích của qPCR là 20-25 µL/phản ứng thì ddPCR sẽ chia nhỏ 20 µL thể tích phản ứng thành khoảng chục ngàn vi giọt. Mỗi vi giọt đều có thể tích bằng nhau (khoảng 1nL/phản ứng) và các vi giọt này sẽ thực hiện một phản ứng độc lập. Sau đó quá trình nhân bản được tiến hành tương tự qPCR, kết quả ghi nhận có hay không có tín hiệu huỳnh quang của vi giọt, phần mềm sẽ áp dụng mô hình phân phối Poisson để tính ra nồng độ DNA mục tiêu.

Do đó kết quả định lượng của ddPCR xem như tuyệt đối vì không cần đường cong chuẩn Ct như qPCR. Bên cạnh đó, điểm mạnh vượt trội của ddPCR so với qPCR đó là có thể phát hiện được sự khác nhau dù là một điểm giữa trình tự của chủng hoang dại và chủng đột biến với tỷ lệ gene mang đột biến dao động dưới 10% . Điều đó là nhờ vào kỹ thuật chia vi giọt đã pha loãng DNA, dẫn đến giảm tín hiệu nền làm giảm mức độ chênh lệch trình tự giữa dạng hoang dại và đột biến, từ đó làm tăng khả năng phát hiện các đột biến có trong mẫu.

Như vậy có thể thấy ddPCR mang những ưu điểm vượt trội và giúp khắc phục hạn chế mà qPCR gặp phải. Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay có chi phí đầu tư cao, thời gian chuẩn bị mẫu lâu hơn và số lượng mẫu xử lý còn ít. Tùy vào ứng dụng mà chọn kỹ thuật phân tích phù hợp, với ddPCR, kỹ thuật này rất phù hợp cho phát hiện các gen mang đột biến hiếm (đột biến điểm hay SNP) được ứng dụng trong điều trị ung thư, phát hiện chỉnh sửa bộ gene hay giám định kết quả giải trình tự NGS cho những đột biến ở tần số thấp.

Ngược lại kỹ thuật qPCR sẽ phù hợp với những ứng dụng đơn giản hơn như phát hiện tác nhân gây bệnh phổ biến (HBV, HCV, HPV hay HIV), đây là những xét nghiệm này đòi hỏi công suất phân tích lớn, chi phí thấp và thời gian gian cho kết quả nhanh chóng. Ngoài ra các ứng dụng khác như nghiên cứu biểu hiện gen, phát hiện siRNA, miRNA hay lncRNA đều nên ưu tiên sử dụng qPCR thay vì kỹ thuật phức tạp như ddPCR.

Hình 9. Sự khác nhau giữa kỹ thuật qPCR (A) và ddPCR (B)

6. Ứng dụng của kỹ thuật real-time PCR

Kỹ thuật real-time PCR là phương pháp khuếch đại gen và đồng thời có thể đọc kết quả ngay tại thời điểm phản ứng xảy ra. Kết quả phân tích sẽ được thông qua tín hiệu huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ của phản ứng. Kỹ thuật này được coi là bước tiến lớn của PCR và đặc biệt được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh, xác định các sinh vật biến đổi gen và kiểu gen các tác nhân gây bệnh. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu, real-time PCR còn phát hiện sự biến đổi trong biểu hiện của một gen qua thông qua định lượng số phiên mã của gen.

6.1 Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm trên người

Đối với bệnh truyền nhiễm, việc xác định tác nhân gây bệnh và cách ly các cá thể bệnh là việc hết sức quan trọng trong kiểm soát dịch bệnh. Các phương pháp chẩn đoán các tác nhân gây bệnh thường dựa vào triệu chứng lâm sàng hay kiểm tra hình ảnh. Trường hợp triệu chứng hay hình ảnh chưa rõ ràng hoặc không đặc trưng thì xét nghiệm real-time PCR được sử dụng để xác định chính xác sự tồn tại và tải lượng của tác nhân gây bệnh, từ đó có thể ngăn ngừa lây lan dịch bệnh và điều trị hiệu quả cho bệnh nhân.

Để đáp ứng yêu cầu việc xét nghiệm qPCR cần kết quả chính xác và nhanh chóng, các nhà nghiên cứu kết hợp với các nhà sản xuất sản phẩm y sinh đã cho ra các bộ kit sẵn sàng cho chẩn đoán các tác nhân phổ biến như HCV, HBV, HPV, bệnh lậu,… Đối với kit sử dụng SYBR Green chỉ phát hiện được đơn tác nhân (singleplex) do tính không đặc hiệu về trình tự của chất huỳnh quang dạng này. Với các bộ kit sử dụng probe có khả năng phát hiện nhiều đoạn gen hay nhiều tác nhân gây bệnh sẽ giúp tối ưu hoá độ nhạy cũng như độ đặc hiệu cho xét nghiệm.

Ví dụ, viêm gan B (Hepatis B Virus – HBV) là vi rút thuộc họ Hepadnaviridae có cấu trúc DNA mạch đôi, đây là bệnh truyền nhiễm ảnh hưởng lớn đến hoạt động của gan, có thể gây nhiễm trùng gan thậm chí đe dọa đến tính mạng. Vì vậy, công tác phát hiện và định lượng chính xác nồng độ HBV trong máu rất quan trọng, giúp việc điều trị cho bệnh nhân dễ dàng hơn. Bộ kit lưu hành hiện nay cũng đã được tối ưu hóa để tăng khả năng phát hiện toàn bộ genotype HBV tại vùng 37S protein gen với độ đặc hiệu và độ nhạy cao.

Bên cạnh đó, các bộ kit HBV ngoài định tính còn cung cấp khả năng định lượng chính xác nồng độ HBV trong mẫu huyết thanh/ huyết tương ở người. Trong bộ kit cung cấp các ống chứa các mẫu đã chuẩn nồng độ, đường chuẩn được xây dựng dựa trên 5 điểm (ống mẫu) mang lại kết quả định lượng chính xác, kết hợp với các hệ thống đối chứng âm, đối chứng dương, đối chứng nội nhằm phát hiện kịp thời các kết quả bất thường, giúp việc theo dõi và điều trị bệnh hiệu quả hơn.

Trong khi đó, đối với virus viêm gan C (Hepatis C Virus – HCV) là kẻ giết người thầm lặng, với tỷ lệ biến chứng xơ gan, ung thư gan cao hơn rất nhiều so với HBV. Cấu trúc gen của HCV có dạng mạch đơn RNA, do vậy cần chuyển đổi thành cDNA để làm khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại. Trên thị trường hiện nay, các bộ kit cũng cung cấp các giải pháp one-step hay two-step tùy vào nhu cầu sử dụng với ưu nhược điểm riêng. Bộ mồi – probe cũng được thiết kế gắn đặc hiệu có khả năng phát hiện toàn bộ genotype HCV tại vùng HCV73 5′ UTR.

Ngoài khả năng phát hiện HCV nhanh trong mẫu bệnh phẩm thì một số kit cũng cung cấp đường chuẩn xác định tải lượng HCV giúp điều trị tốt hơn. Hay các kit xét nghiệm SARS-COV-2 lưu hành trên thị trường hiện nay có thể phát hiện các gen đặc trưng của vi rút bao gồm gen N, gen E và RdRp. Một công bố trên Tạp chí Nature gần đây đã cải tiến kỹ thuật multiplex qPCR không chỉ phát hiện các gen trên vi rút mà còn gen RP ở người để gia tăng hiệu quả xét nghiệm [Tombuloglu et al., 2022].

6.2. Chẩn đoán bệnh trên thú y, thủy sản

Các bệnh lây truyền từ động vật sang người đang có chiều hướng ngày càng gia tăng. Thông thường các trang trại vẫn khá lơ là trong việc phòng ngừa dịch bệnh, khi các ổ dịch bùng phát thì mới có hành động khắc phục hậu quả và quan tâm xây dựng biện pháp ngăn ngừa mầm bệnh xâm nhập.

Để chẩn đoán bệnh trên vật nuôi, người dân hay kiểm tra bằng cảm quan như các triệu chứng trên da, nhiệt độ cơ thể, theo dõi sức ăn và hoạt động của vật nuôi,… Tuy nhiên các phương pháp này thường không chính xác và khó phát hiện sớm các mầm bệnh. Để hạn chế thiệt hại, việc tăng khả năng ứng dụng công nghệ cao trong chẩn đoán, giám sát dịch bệnh trên động vật là rất cần thiết.

Một số phương pháp được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn, vi rút gây bệnh trên vật nuôi như: phân lập nuôi cấy vi sinh truyền thống, thử nghiệm sinh hóa truyền thống, kit test nhanh, Elisa,… Điểm chung của các phương pháp này đều có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao hoặc thời gian thử nghiệm lâu, không phù hợp với các đơn vị sản xuất cần kết quả nhanh và có độ tin cậy cao.

Để đáp ứng những nhu cầu trên, xét nghiệm real-time PCR là một trong những công cụ chẩn đoán phổ biến nhất ngày nay được sử dụng trong thú y, thủy sản. Kỹ thuật này không chỉ được sử dụng cho mục đích chẩn đoán mà còn là phương tiện để cải thiện an toàn sinh học thông qua giám sát và theo dõi dịch bệnh.

Với sự phát triển kỹ thuật qPCR, các dòng kit phát hiện bệnh ngày càng đa dạng trên vật nuôi để phát hiện các vật liệu di truyền là DNA hoặc RNA của các tác nhân gây bệnh (như vi khuẩn, vi rút, vi bào tử), thông qua hệ mồi – mẫu dò đặc hiệu có độ chính xác rất cao và kết quả có thể đọc trực tiếp trên máy tính trong thời gian ngắn. Các dòng kit phổ biến trên đa dạng bệnh như: Bệnh tả lợn châu Phi do African Swine Fever Virus (ASFV), lở mồm long móng do Foot and Mouth Disease Virus (FMDV), dịch tả heo cổ điển do Classical Swine Fever Virus (CSFV), …

Bên cạnh đó, nuôi trồng thủy sản cũng là một trong những ngành công nghiệp phát triển nhanh nhất ở nước ta. Việc thâm canh nuôi tôm mật độ cao ngày càng nhiều, kéo theo nhiều thách thức và rủi ro. Các đại dịch trên tôm như đốm trắng (WSSV), Hội chứng tôm chết sớm hay bệnh hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND), bệnh đầu vàng YHV, hoại tử cơ quan tạo máu và biểu mô IHHNV,… từng gây tổn thất hàng trăm ngàn tấn tôm thiệt hại hàng tỷ USD mỗi năm cho ngành tôm toàn cầu.

Thông thường để chẩn đoán bệnh cho tôm, người dân hay sử dụng kinh nghiệm nuôi lâu năm như kiểm tra bằng cảm quan các triệu chứng trên mang, vảy, hiện tượng của nước ao nuôi, tình trạng vật nuôi, … Tuy nhiên, những phương pháp này thường không chính xác và khó có thể phát hiện sớm được mầm bệnh. Do đó, việc phòng ngừa dịch bệnh trên thủy sản có ý nghĩa quan trọng, giảm thiểu thiệt hại cho người nuôi, định hướng cách xử lý nhằm giảm thiểu rủi ro đến mức thấp nhất.

Nhiều nhà sản xuất đã cung cấp nhiều dòng sản phẩm kit chẩn đoán đa dạng tác nhân gây bệnh trên tôm, sử dụng cho các xét nghiệm trước và trong suốt quá trình nuôi nhằm tầm soát nguy cơ nhiễm bệnh, phát hiện sớm được mầm bệnh trong môi trường nuôi. Đặc biệt là những bệnh có nguy cơ tử vong cao hoặc nằm trong yêu cầu xét nghiệm để đủ điều kiện xuất nhập khẩu qua các thị trường nước ngoài.

6.3 Xác định thực phẩm GMO

Thực phẩm biến đổi gen hay còn gọi là thực phẩm GM (Genetically modified) được dùng để chỉ các loại thực phẩm có thành phần từ cây trồng hay động vật biến đổi gen. Sự an toàn về thực phẩm GM hiện nay vẫn là chủ đề nóng gây tranh cãi thời gian qua, mặc dù tổ chức WHO và FAO chưa có báo cáo nào đề cập đến những tác động nguy hại ở mức báo động của GMO cho người sử dụng như đột biến hay gây tử vong.

Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu khoa học cũng cho thấy loại thực phẩm này có khả năng gây dị ứng, gây kháng kháng sinh hay rối loạn quá trình chuyển hóa. Luật ghi nhãn bắt buộc thường có hiệu lực dựa trên tỷ lệ GMO của bất kỳ thành phần cụ thể nào trong một sản phẩm thực phẩm, mặc dù một số quy định dựa trên tỷ lệ phần trăm trên toàn bộ mặt hàng thực phẩm. Các quy tắc hạn chế nhất, như Liên minh châu Âu, Ả Rập Xê-út, Thổ Nhĩ Kỳ và Úc, có ngưỡng 0,9%.

Những nước khác cho phép bao gồm GMO ở mức độ cao hơn, với Hàn Quốc là 3% và Nhật Bản là 5%. Úc và New Zealand yêu cầu các thành phần GMO phải được ghi chú trong bảng thành phần, trừ khi toàn bộ mặt hàng là biến đổi gen. Trong trường hợp đó, thông tin phải được bao gồm bên cạnh tên, theo Cơ quan Tiêu chuẩn Thực phẩm Australia, New Zealand. Hàn Quốc có ngưỡng dán nhãn GMO cao hơn, với bất kỳ thứ gì dưới 3% được coi là không cố ý.

Do vậy, kiểm nghiệm thực phẩm biến đổi gen là điều cần thiết để xác nhận và định lượng sinh vật biến đổi gen trong các mẫu thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi. Kỹ thuật real-time PCR thường được ứng dụng hiệu quả trong dán nhãn và xác định hàm lượng GMO. Mỗi tổ chức hay quốc gia sẽ quy định phần trăm GMO để dán nhãn cho mẫu, do đó để giúp doanh nghiệp thực phẩm có thể xuất khẩu vào các thị trường trên thế giới, việc phát hiện sinh vật biến đổi gen là rất quan trọng.

PCR khác gì Realtime PCR?

RT-PCR và PCR cùng là phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử. Về bản chất, PCR là định tính (chỉ cho biết có sợi ADN của virus hay không, không định lượng được virus; còn RT-PCR là bán định lượng, ngoài việc phát hiện sợi DNA, còn xác định tải lượng virus đang có trong cơ thể người bệnh, do đó RT-PCR ưu việt hơn.

Khi nào dùng Realtime PCR?

Kỹ thuật xét nghiệm Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích. Xét nghiệm Realtime PCR trở nên hữu dụng để định danh và mô tả chính xác những tác nhân gây bệnh, có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh lây truyền qua đường tình dục.

Xét nghiệm HSV Realtime PCR là gì?

✴️ HSV Real-time PCR. Phát hiện DNA đặc trưng của virus herpes trong dịch não tủy, dịch vết loét hoặc mảnh sinh thiết. Phát hiện DNA đặc trưng của virus herpes dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time PCR. Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Xét nghiệm Neisseria gonorrhoeae Realtime PCR là gì?

✴️ Neisseria gonorrhoreae Real-time PCRXác định sự có mặt của Neisseria gonorrhoeae trong bệnh phẩm dịch niệu đạo, cổ tử cung hoặc dịch cơ thể có nghi ngờ có căn nguyên N. gonorrhoeae. Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.