Việc phát minh ra phản ứng chuỗi polymerase [PCR] của Kary Mullis vào năm 1984 được coi là một cuộc cách mạng trong khoa học. Tuy nhiên, kết quả phản ứng PCR chỉ được biết sau khi hoàn thành và phải thực hiện một số kỹ thuật đi kèm khác như điện di hay đo OD [Optical density]. Bên cạnh đó, kết quả ghi nhận được của phản ứng là nồng độ cuối cùng của sản phẩm PCR, trong khi sự thay đổi nồng độ trong quá trình phản ứng cũng như ảnh hưởng của lượng mẫu đầu vào đến kết quả không được ghi nhận.
Để khắc phục được những vấn đề này, PCR đã được cải tiến thành real-time PCR [hay PCR], đây được coi là một bước nhảy vọt về công nghệ vào cuối thế kỷ 20, giúp mở ra những ứng dụng mới vượt bậc cho các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới. Máy real-time PCR lần đầu tiên được thương mại hóa bởi Applied Biosystems vào năm 1996, công nghệ này nhanh chóng phát triển thành một thị trường cạnh tranh, hàng loạt các công ty kinh doanh sản phẩm sinh học cho ra mắt các dòng máy real-time PCR.
Về mặt định nghĩa, kỹ thuật real-time PCR cho phép biết được số lượng bản sao DNA mục tiêu tạo ra ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng bằng công nghệ huỳnh quang. Ngoài việc có thể xác định được sự có mặt của trình tự DNA mục tiêu [Real-time PCR định tính], qPCR còn có thể định lượng được DNA mục tiêu [qPCR định lượng] có trong mẫu ban đầu qua mỗi chu kỳ.
2. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật real-time PCR
Tương tự như PCR, kỹ thuật real-time PCR cũng bao gồm các thành phần cơ bản như dNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn, cặp mồi và dung dịch đệm. Điểm khác biệt đó là real-time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang để máy có thể phát hiện và đo được cường độ tín hiệu từ chất này. Khi phản ứng nhân bản xảy ra tới một chu kỳ nhất định, cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ bắt đầu có sự gia tăng rõ rệt và tương quan với số lượng bản sao DNA được tạo ra.
Kết quả được thể hiện dưới dạng biểu đồ quan sát được qua mỗi chu kỳ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về hiệu quả khuếch đại DNA mục tiêu. Real-time PCR yêu cầu có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ ống mẫu và cài chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả về sự biến đổi cường độ huỳnh quang.
Chu trình nhiệt của real-time PCR cũng có 3 giai đoạn cơ bản tương tự như PCR bao gồm:
– Giai đoạn biến tính: Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 94-950C, lúc này liên kết hydro giữa các bazơ trong sợi DNA mạch đôi bị phá vỡ, dẫn đến tạo thành 2 sợi đơn DNA. Mỗi sợi đơn này trở thành khuôn để tổng hợp mạch mới. Thời gian biến tính có thể tăng lên nếu thành phần khuôn có nhiều GC.
– Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-650C trong 20-40 giây để probe và mồi gắn lần lượt vào sợi DNA khuôn và bắt đầu quá trình tổng hợp mạch mới nhờ vào sự hoạt động của DNA polymerase.
– Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng tăng lên 720C, đây là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động tổng hợp mạch mới của DNA polymerase. Giai đoạn này không bắt buộc ở một số chu trình qPCR, do kỹ thuật này thường dùng khuếch đại các đoạn có trình tự ngắn hơn PCR, vào khoảng