So sánh vector tạo dòng và vector biểu hiện

Tóm tắt nội dung tài liệu

1. Chương 4 CÁC VECTOR VÀ SỰ TẠO DÒNG I. Các vector 1. Khái niệm Phân tử DNA có kích thước nhỏ, thường có dạng vòng, dùng để mang gene. 2. Đặc điểm: - Có khả năng sao chép độc lập. - Có thể thu nhận lượng lớn từ tế bào. - Mang gene chỉ thị cho quá trình sàng lọc [gene kháng kháng sinh, gene mã hóa cho enzyme chuyển hóa cơ chất]. - Có những vị trí duy nhất của enzyme giới hạn.
2. I. Các vector [tt] 3. Vector tạo dòng và vector biểu hiện - Vector tạo dòng: chuyển và löu tröõ gene taùi toå hôïp trong teá baøo chuû. - Vector biểu hiện: taïo ra saûn phaåm cuûa gene taùi toå hôïp ôû möùc phieân maõ, dòch maõ, phaân tích trình töï ñieàu hoøa söï bieåu hieän cuûa gene.
3. 4. Phân loại: - Có nhiều loại vector: plasmid, cosmid, phage… -Dựa vào kích thước DNA mục tiêu và mục đích tạo dòng  chọn loại vector phù hợp. Plasmid: DNA ngắn, dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên ở vi khuẩn. Plasmid thế hệ thứ I: plasmid tìm thấy trong tự nhiên. Plasmid thế hệ thứ II: plasmid nhân tạo, điển hình là pBR322. Plasmid thế hệ thứ III: plasmid mạnh nhất, có 2 đặc tính cơ bản: - Kích thước nhỏ  sao chép nhanh chóng. - Có mang polylinker [vị trí chứa các trình tự nhận biết duy nhất của enzyme cắt giới]
4. Phage: virus xâm nhiễm và làm tan vi khuẩn. Hiệu quả xâm nhiễm cao hơn chuyển plasmid vào vi khuẩn, nhưng thao tác phức tạp. Cosmid: vector nhân tạo, có thêm trình tự cos của phage λ. Các vector là virus của Eukaryote như: retrovirus, SV 40, vaccinia, adenovirus… Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men [YAC]: vector tạo dòng những đoạn DNA có kích thước lớn.
5. II. Các tế bào chủ - Tế bào tiếp nhận vector: + Duy trì vector bền vũng trong tế bào + Cho phép sao mã [nhân bản sao] vector bên trong tế bào + Cho phép biểu hiện gen được mang bởi vector - Tế bào chủ và vector phải tương thích với nhau về quá trình sao mã, phiên mã và dịch mã - Tế bào chủ thường không ở dạng tự nhiên mà là dạng đột biến chứa kiểu gen đáp ứng với vector và mục đích tạo dòng hoặc biểu hiện gen. - Tế bào chủ: tế bào vi khuẩn hoặc tế bào Eukaryote [tế bào động vật, thực vật, nấm men].
6. III. Sự tạo dòng Mục đích: thu được lượng lớn bản sao một trình tự DNA xác định. Các bước cơ bản: 1. Chọn và xử lí vector: 2. Xử lí DNA cần tạo dòng. 3. Tạo vector tái tổ hợp. 4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 5. Phát hiện dòng cần tìm
7. Chọn và xử lí vector: Chọn vector phụ thuộc vào: kích thước DNA tạo dòng và mục đích Sử dụng enzyme cắt hạn chế thích hợp để cắt mở vòng. So sánh vector theo kích thước DNA mục tiêu - Plasmid: nhỏ hơn 8kb [trừ plasmid từ F – BAC] - Phage λ: đến 20kb - Phage P1: đến 100kb - Plasmid từ F [BAC]: đến 300kb Vector mang được đoạn gen lớn cần cho việc thiết lập các ngân hàng gen
8. 1. Xử lí DNA cần tạo dòng: Cần xác định nguồn thu nhận DNA. Sử dụng phương pháp đặc hiệu thu nhận DNA mục tiêu: tách chiết DNA bộ gene; tổng hợp hóa học… Xử lí DNA mục tiêu với enzyme cắt hạn chế thích hợp: sử dụng enzyme cắt tạo đầu so le hoặc enzyme tạo đầu bằng để tạo đầu tương thích với 2 đầu của vector đã xử lí. 1. Tạo vector tái tổ hợp Thực hiện phản ứng nối giữa DNA mục tiêu và vector [theo tỉ lệ 3:1 hoặc 2:1]. 4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: Sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp.
9. Phương pháp chuyển gene vào tế bào:  Biến nạp [transformation]: - Biến nạp: sự tiếp nhận DNA trần bởi tế bào - Các kĩ thuật sử dụng: + Sử dụng Calcium phosphate [hoặc Calcium clorua]: hình thành phức hợp DNA-calcium, chuyển vào tế bào qua cơ chế thực bào. + Điện biến nạp [electroporation]: sử dụng dòng điện có điện áp cao, tạo lỗ thủng trên màng tế bào, DNA dễ xâm nhập vào bên trong tế bào. + Kĩ thuật tiêm [injection]: DNA được bắn vào tế bào dưới dạng bọc quanh những viên đạn cực nhỏ, hoặc được tiêm thẳng vào tế bào.
10. Tạo tế bào E. coli khả nạp [competent cell] và biến nạp DNA - Đa số tế bào không có khả năng biến nạp - Tế bào có thể được xử lý để trở nên có khả năng tiếp nhận DNA trần: sự tạo tế bào khả nạp [competent cell].
11. Chuyển gen vào tế bào khác vi khuẩn - Nấm men: tạo competent cell bằng xử lý với lithium chloride hoặc lithium acetate; sử dụng xung điện [electroporation]; - Nấm mốc: electroporation, protoplast -Tế bào thực vật: biến nạp bằng Agrobacterium tumefaciens electroporation, súng bắn gene - Tế bào động vật: biến nạp, vi tiêm... a] Electroporation
12. Phương pháp chuyển gene vào tế bào [tt]  Tải nạp [transduction]: Quá trình chuyển gene vào tế bào nhờ vector là virus. Ưu điểm: hiệu quả chuyển gene cao. Virus sử dụng trong quá trình tải nạp được loại bỏ một phần bộ gene, gắn thay vào đó đoạn DNA cần nghiên cứu.
13. 5. Phát hiện dòng cần tìm Tách chiết thu nhận vector tái tổ hợp và kiểm tra bằng enzyme cắt. Vector tái tổ hợp sẽ có kích thước lớn hơn vector ban đầu. Sử dụng mẫu dò: - Kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa bởi gene cần tìm. - Trình tự DNA bổ sung cho gene cần tìm.
14. Phương pháp sử dụng kháng thể: + Có 1 kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa. + Vector sử dụng là vector cho phép dịch mã DNA thành protein.
15. Phương pháp sử dụng trình tự DNA bổ sung cho gene cần tìm. • Tổng hợp các trình tự DNA ngắn và đánh dấu ở đầu 5’ bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng hóa chất nhờ enzyme polynucleotide kinase. • Tiến hành lai các trình tự DNA ngắn trên với các dòng trong thư viện gene. Dòng tái tổ hợp được phát hiện bằng kĩ thuật phóng xạ hoặc tín hiệu màu.
16. IV. Thư viện gene Dựa vào bản chất của DNA cần tạo dòng, có 2 loại thư viện gene - Thư viện bộ gene [genomic library]: tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gene đã được gắn vào vector. Cách tiến hành: Tách chiết DNA bộ gene  cắt bộ gene thành những đoạn có kích thước xác định  dòng hóa vào vector  chuyển gene vào tế bào chủ  nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng [clone]. Ứng dụng: - Giải mã bộ gene. - Tạo dòng các trình tự DNA không mã hóa
17. -Thư viện cDNA [cDNA library]: tập hợp các bản sao của cDNA từ tất cả các mRNA của tế bào. - Thư viện cDNA mang tính đặc trưng của tế bào rất cao vì chỉ có 1 số gene được phiên mã thành mRNA -Kích thước của cDNA không lớn  chọn vector dòng hóa dễ dàng. Cách tiến hành: tách chiết, thu nhận mRNA  cDNA  dòng hóa vào vector  chuyển gene vào tế bào chủ  nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng [clone].
18. • Bài tập: Cho gene A [kích thước 300 bp] có trình tự như sau: Trình bày cách thu nhận và dòng hóa gene vào vector pEGFP-N1? SalI EcoRI SalI Xho I G ene  A HindIII BamHI

Page 2

YOMEDIA

Phân tử DNA có kích thước nhỏ, thường có dạng vòng, dùng để mang gene. Đặc điểm: Có khả năng sao chép độc lập. Có thể thu nhận lượng lớn từ tế bào. Mang gene chỉ thị cho quá trình sàng lọc [gene kháng kháng sinh, gene mã hóa cho enzyme chuyển hóa cơ chất]. Có những vị trí duy nhất của enzyme giới hạn.

24-10-2010 533 103

Download

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2009-2019 TaiLieu.VN. All rights reserved.

Các sự khác biệt chính giữa vectơ nhân bản và vectơ biểu thức là Vectơ nhân bản mang một đoạn DNA ngoại lai vào tế bào chủ trong khi vectơ biểu hiện tạo điều kiện cho sự biểu hiện của gen thành protein.

Vector là một thuật ngữ quan trọng trong sinh học phân tử. Trong công nghệ DNA tái tổ hợp, vai trò chính của vectơ là cung cấp chế độ vận chuyển đến một phần DNA hữu ích để đưa vào tế bào chủ. Hơn nữa, nó là một phân tử DNA được sử dụng để mang một đoạn DNA ngoại lai nhân tạo vào một tế bào chủ để được biểu hiện hoặc sao chép. Các vectơ được sử dụng nhiều nhất là các plasmid, vectơ virus, cosmids và nhiễm sắc thể nhân tạo. Vectơ nhân bản và vectơ biểu thức là hai loại vectơ được phân loại dựa trên ứng dụng của chúng.

NỘI DUNG

1. Tổng quan và sự khác biệt chính2. Vector nhân bản là gì 3. Vector biểu hiện là gì4. Điểm tương đồng giữa Vector nhân bản và Vector biểu hiện5. So sánh cạnh nhau - Vector nhân bản vs Vector biểu hiện ở dạng bảng

6. Tóm tắt

Vector nhân bản là gì?

Vectơ nhân bản là một phần của DNA có thể được sử dụng để chèn một phân tử DNA ngoại lai và có khả năng được chèn vào vật chủ cho mục đích nhân bản. Một đặc điểm lý tưởng của một vectơ nhân bản là dễ dàng chèn / loại bỏ đoạn DNA bằng cách xử lý enzyme hạn chế và điều trị enzyme ligating. Trong khía cạnh này, các vectơ nhân bản được sử dụng thường xuyên là các plasmid biến đổi gen.

Hình 01: Vector nhân bản

Một vectơ nhân bản nên có một vị trí nhân bản, một gen đánh dấu có thể lựa chọn và một gen phóng viên. Mục đích của một trang web nhân bản là cung cấp một nơi để nhân bản xảy ra. Một gen đánh dấu có thể lựa chọn giúp xác định tái tổ hợp thành công sau khi nhân bản và gen phóng viên cho phép sàng lọc và xác định tái tổ hợp chính xác trong số các tái tổ hợp sau khi nhân bản. Vectơ nhân bản không nhất thiết giúp thể hiện protein mà DNA ngoại mã hóa. Do đó, mục đích duy nhất của vectơ nhân bản là mang DNA ngoại lai đến vật chủ.

Vector biểu hiện là gì?

Vectơ biểu hiện, còn được gọi là cấu trúc biểu thức, là một loại vectơ được sử dụng để biểu hiện các protein bên trong tế bào chủ. Giống như bất kỳ vectơ nào, phần này cũng nên chứa các phần chính của một trang web nhân bản, một gen đánh dấu và một gen phóng viên. Vectơ giới thiệu một gen mới vào vật chủ và sử dụng cơ chế tổng hợp protein của vật chủ, nó cho phép gen được biểu hiện vào vật chủ. Hơn nữa, trọng tâm ban đầu của nó là tạo ra m-RNA ổn định và từ đó tạo ra protein. Một ví dụ điển hình là việc sản xuất insulin thương mại. Gen insulin được đưa vào một plasmid của vi khuẩn và đưa trở lại vào cơ thể vi khuẩn E. coli, cho phép các plasmid nhân lên và cho phép E. coli phát triển, tiết ra insulin có thể được thu thập và sử dụng.

Hình 02: Vector biểu thức

Hơn nữa, một vectơ biểu thức nên có một vùng quảng bá mạnh, một chuỗi khởi tạo dịch chính xác và một codon terminator đúng và một chuỗi. Các vec tơ biểu hiện có nhiều ứng dụng trong việc sản xuất peptide và protein cho ngành dược phẩm như sản xuất insulin, hormone tăng trưởng, kháng sinh, vắc-xin, kháng thể. Hơn nữa, vectơ biểu hiện giúp sản xuất enzyme trong ngành công nghiệp thực phẩm và may mặc. Không chỉ vậy, vectơ biểu hiện rất cần thiết trong sản xuất cây chuyển gen như lúa vàng, cây chống côn trùng, cây kháng thuốc diệt cỏ, v.v..

Điểm giống nhau giữa Vector nhân bản và Vector biểu hiện là gì?

• Vectơ nhân bản và vectơ biểu hiện là hai loại vectơ chúng ta sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp và kỹ thuật di truyền.
• Cả hai đều chứa một gen đánh dấu và một gen phóng viên.
• Hơn nữa, chúng bao gồm nhiều trang web nhân bản.
• Ngoài ra, chúng có nguồn gốc sao chép và khả năng tự sao chép.

Sự khác biệt giữa Vector nhân bản và Vector biểu hiện là gì?

Vectơ nhân bản là một phân tử DNA nhỏ mang đoạn DNA ngoại lai vào tế bào chủ trong khi vectơ biểu hiện là một loại vectơ tạo điều kiện cho việc giới thiệu, biểu hiện gen và sản xuất protein. Vì vậy, đây là sự khác biệt chính giữa vectơ nhân bản và vectơ biểu thức. Hơn nữa, một sự khác biệt đáng kể khác giữa vectơ nhân bản và vectơ biểu hiện là vectơ nhân bản đưa đoạn DNA ngoại lai vào vật chủ trong khi vectơ biểu hiện biểu hiện gen được giới thiệu bằng cách tạo ra protein có liên quan.

Hơn nữa, vector nhân bản bao gồm một nguồn gốc của sao chép, các trang web hạn chế và một điểm đánh dấu có thể lựa chọn. Trong khi, vectơ biểu thức chứa các chất tăng cường, vùng quảng bá, codon kết thúc, trình tự khởi tạo phiên mã, nguồn gốc của sao chép, các trang web hạn chế và một điểm đánh dấu có thể chọn. Do đó, đây cũng là một sự khác biệt giữa vectơ nhân bản và vectơ biểu thức. Bên cạnh đó, plasmid, vi khuẩn, nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn, cosmids, nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú, nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men, v.v., là những ví dụ về vectơ nhân bản. Trong khi đó, vectơ biểu hiện chủ yếu là các plasmid.

Tóm tắt - Vector nhân bản vs Vector biểu hiện

Dựa vào chức năng của chúng trong sinh học phân tử, có hai loại vectơ là vectơ nhân bản và vectơ biểu thức. Một vectơ nhân bản là một phân tử DNA nhỏ đưa DNA ngoại lai vào tế bào chủ. Có nhiều loại vectơ nhân bản khác nhau như plasmid, vi khuẩn, nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn, cosmids và nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú. Ngược lại, một vec tơ biểu hiện là một plasmid đưa gen quan tâm vào tế bào chủ và tạo điều kiện cho biểu hiện gen thu được sản phẩm protein. Các vectơ biểu hiện là các plasmid. Vì vậy, đây là tóm tắt về sự khác biệt giữa vectơ nhân bản và vectơ biểu thức.

1. Vector Expression Vector. Wikipedia, Wikimedia Foundation, ngày 30 tháng 4 năm 2019, Có sẵn tại đây.
2. Tạm biệt, Harvey. Nhân bản DNA DNA với Plasmid vectơ. Sinh học tế bào phân tử. Phiên bản thứ 4., Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ, ngày 1 tháng 1 năm 1970, Có sẵn tại đây.

1. Các vectơ nhân bản BACs của chem114A Hóa bởi Zoragon7 - Công việc riêng [CC BY-SA 4.0] qua Commons Wikimedia
2. Bản sao của Ampe Amp của Tin Byella - [CC BY-SA 3.0] qua Commons Wikimedia